微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-聚谷氨酸.pdf

1、本文利用本實驗篩選的枯草芽孢桿菌PGAN-12搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA,對γ-PGA的對照品的制備和γ-PGA的定量檢測、菌體的營養(yǎng)需求和發(fā)酵條件進(jìn)行研究以提高γ-PGA的發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度.論文的主要工作及結(jié)論有:(1)γ-PGA對照品的制備和γ-PGA檢測方法的建立γ-PGA分離提純采用超濾后去除小分子,然后冷凍干燥,得到對照品.并以此作標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測發(fā)酵液γ-PGA的含量.采用凝膠滲透色譜法(GPC法)定量分析γ-PGA,GPC條件

2、本檢測采用BEKMAN COULTER System Gold 125/166,Pharmacia Biotech Superose<'TM>6尺寸排阻凝膠色譜柱,數(shù)據(jù)采集及處理采用32 Karat 5.0 version色譜工作站,洗脫液為0.15mol/L NaCl+0.05M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2),所用的水均為重蒸水,進(jìn)樣前用0.45μm水性超濾膜過濾.(2)發(fā)酵條件優(yōu)化發(fā)酵所用的種子液成分為:葡萄糖20g/L,酵母膏5g/

3、L,K<,2>HPO<,4>2 g/L,MgSO<,4> 0.25g/L,谷氨酸鈉10g/L;pH7.0;種子培養(yǎng)時間為15小時,最佳接種量為1﹪.PGAN-12合成γ-聚谷氨酸的合適碳源為葡萄糖,而TCA循環(huán)中的有機(jī)酸包括檸檬酸均不能使PGAN-12合成.最適的氮源是酵母膏.PGAN-12是谷氨酸依賴型的γ-PGA產(chǎn)生菌,在谷氨酸鈉濃度為70g/L時,γ-PGA取得最大的產(chǎn)量為18.32g/L,但在谷氨酸鈉濃度為30g/L時,獲得了最

4、大的表觀轉(zhuǎn)化率,為62.1﹪,此時生成γ-PGA為14.2g/L.通過谷氨酸鈉,葡萄糖,酵母膏的正交實驗,得合適的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖40g/L,酵母膏8g/L,K<,2>HPO<,4>·3H<,2>O 2 g/L,MgSO<,4> 0.25g/L,谷氨酸鈉40g/L,按此培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,經(jīng)過24小時后,γ-PGA達(dá)到最高產(chǎn)量,為18.5g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為0.77g/L.h.發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH利為7.5.與自然初始pH相近;在搖

5、床220r/min的情況下,500mL三角瓶的最佳裝液量為80mL.(3)發(fā)酵過程的搖補(bǔ)料研究以補(bǔ)料工藝來強(qiáng)化γ-PGA的生產(chǎn).叢枯草芽孢桿菌PGAN-12搖瓶發(fā)酵制備γ-PGA的過程曲線可知,葡萄糖是γ-PGA產(chǎn)量增長的制約因素,根據(jù)這個原則設(shè)計補(bǔ)料液成分和濃度,得到合適的補(bǔ)料液的濃度為(每升):葡萄糖70g,酵母膏20g,K<,2>HPO<,4>.3H<,2>O<,4>g,MgSO<,4> 0.5g谷氨酸鈉70g,補(bǔ)料時取5mL.在

6、發(fā)酵進(jìn)行到18h時補(bǔ)料,發(fā)酵經(jīng)過總共28h,γ-PGA的產(chǎn)量為23.8g/L,補(bǔ)料過程中γ-PGA生產(chǎn)強(qiáng)度為0.85g/(L.h).(4)不同金屬離子對γ-PGA合成的影響在生產(chǎn)枯草芽孢桿菌PGAN-12發(fā)酵制備γ-PGA過程中,研究了金屬離子Ca<'2+>、Mn<'2+>、Mo<'6+>、Mg<'2+>、Co<'2+>、Fe<'3+>、K<'+>對γ-PGA發(fā)酵的影響,通過進(jìn)行單獨離子對發(fā)酵影響的研究工作,發(fā)現(xiàn)Ca<'2+>、Mn<'

7、2+>、Mo<'6+>、Mg<'2+>、Co<'2+>、K<'+>后在合適的濃度時都能顯著提高γ-PGA的產(chǎn)量,然后進(jìn)行各種離子的復(fù)配,得到合適的含各種金屬離子培養(yǎng)基為:葡萄糖40g/L,酵母膏8g/L,谷氨酸鈉40g/L,K<,2>HPO<,4>·3H<,2>O 20 g/L,K<,2>HPO<,4>·3H<,2>O 20g/L,MgSO4 0.1 g/L,MaSO<,4> 0.12g/L,CoCl<,2> 0.02 g/L,CaCl