NaCl濃度和pH值變化對(duì)陰溝腸桿菌腐胺代謝的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機(jī)化合物的總稱。人體攝入過(guò)多的生物胺會(huì)產(chǎn)生不良的生理反應(yīng)，嚴(yán)重會(huì)威脅生命。腐胺是食物中最常見(jiàn)的生物胺之一，它不僅能造成食品的腐敗味，而且能增強(qiáng)其它生物胺的毒理學(xué)反應(yīng)，也是致癌物亞硝胺形成的前體。研究報(bào)道食品中生物胺的產(chǎn)生主要由污染的腐敗菌代謝而來(lái)，并且其代謝途徑也受環(huán)境因素的影響。因此闡明環(huán)境條件如何影響食品中腐敗菌的生物胺產(chǎn)生能力，降低生物胺的累積量具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌是雞肉中

2、的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，并且代謝產(chǎn)生大量的腐胺。本研究以陰溝腸桿菌C4為研究對(duì)象，在解析該菌的腐胺代謝途徑的基礎(chǔ)上，研究食品加工中兩個(gè)主要的環(huán)境因子（pH、NaCl濃度）的變化對(duì)該菌腐胺產(chǎn)生的影響及作用機(jī)制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別加入0.5％精氨酸和0.5％鳥(niǎo)氨酸這兩種不同的底物，將活化好的菌液按1％接種量接種于不同的培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)，在不同時(shí)間段測(cè)定菌液的OD值、pH值和腐胺積累量。研究發(fā)現(xiàn)，加

3、入鳥(niǎo)氨酸的菌液中腐胺積累量要遠(yuǎn)高于加入精氨酸菌液的積累量。因此，陰溝腸桿菌中腐胺的產(chǎn)生主要通過(guò)鳥(niǎo)氨酸的代謝過(guò)程完成，而由精氨酸產(chǎn)生的腐胺含量極少。⑵配制含有0.5％鳥(niǎo)氨酸的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，將pH分別調(diào)為9、8、5、4并滅菌。將活化好的菌種按1％接種量接種于不同的培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)，在不同時(shí)間段測(cè)定菌液的OD值、pH值、鳥(niǎo)氨酸含量及腐胺積累量。研究發(fā)現(xiàn)隨著pH值的降低陰溝腸桿菌的生長(zhǎng)曲線幾乎一致，但是最終上清液中鳥(niǎo)氨酸的含量逐漸降

4、低，腐胺積累量逐漸升高。然后分析了不同初始pH處理下陰溝腸桿菌在對(duì)數(shù)期時(shí)與腐胺產(chǎn)生相關(guān)的三個(gè)基因（鯡精胺酶基因（agm）、精氨酸脫羧酶基因(arg)和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因（orn））的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)agm和arg基因的表達(dá)量隨著pH的改變沒(méi)有顯著變化，而orn基因的表達(dá)量隨pH的升高顯著降低。這說(shuō)明陰溝腸桿菌在酸性條件下代謝鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)生大量的腐胺，并且與鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因表達(dá)量的增加有關(guān)。⑶配制0.5％鳥(niǎo)氨酸的培養(yǎng)基(pH4)，然后加入0％、

5、2％、4％、6％、8％的NaCl并滅菌。將活化好的菌種按1％接種量接種于不同的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，在不同時(shí)間段測(cè)定菌液的OD值、pH值、鳥(niǎo)氨酸含量及腐胺積累量。研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的升高，陰溝腸桿菌的生長(zhǎng)和腐胺的產(chǎn)量會(huì)受到不同程度的抑制，其中4％NaCl濃度會(huì)抑制該菌前期生長(zhǎng)但是后期生長(zhǎng)正常，但是在該條件下腐胺積累量一直沒(méi)有增加。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了不同NaCl條件下該菌在對(duì)數(shù)期時(shí)鯡精胺酶基因（

6、agm），精氨酸脫羧酶基因（arg）和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因（orn）的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)NaCl濃度的升高會(huì)顯著抑制orn基因的表達(dá)量。綜上，高鹽濃度會(huì)抑制陰溝腸桿菌的生長(zhǎng)和腐胺的產(chǎn)生，但是低鹽濃度下陰溝腸桿菌雖然繼續(xù)生長(zhǎng)，但腐胺積累量卻大幅下降，主要是由于鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因的表達(dá)量受到抑制造成的。⑷體外重組表達(dá)了陰溝腸桿菌鳥(niǎo)氨酸脫羧酶并分析了該酶活受環(huán)境因子變化的影響，對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速率(Vm)、最適pH、最適溫度

7、等進(jìn)行了研究，同時(shí)也研究了NaCl濃度對(duì)酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的Km為1.666 mM，Vmax為6.398 U/mg。最適溫度為30℃，最適pH為6.0。NaCl濃度為1.5％時(shí)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性要略高于其它組。綜上，陰溝腸桿菌在低pH脅迫條件下，腐胺積累量高而酶的活性很弱，說(shuō)明腐胺的產(chǎn)生主要是由于菌株內(nèi)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因的大量表達(dá)引起的。腐胺的產(chǎn)生還會(huì)隨NaCl濃度的升高而受到抑制，原因是NaCl濃度升高除了抑制菌株的生長(zhǎng)外