球等鞭金藻的遺傳多樣性與高D HA和EPA品系的定向選育.pdf

1、球等鞭金藻是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料微藻，廣泛應(yīng)用于貝類和海參的育苗過(guò)程中，其顯著的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在于不僅具有較高的DH A含量，而且也能合成少量的EPA，研究表明，多數(shù)海水養(yǎng)殖動(dòng)物以 DHA和 EPA作為必需脂肪酸，適當(dāng)?shù)腄H A/EPA比率能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物幼苗的孵化率，增強(qiáng)成體的免疫能力。然而，球等鞭金藻藻種經(jīng)過(guò)多年的使用，往往存在著種質(zhì)退化的現(xiàn)象，表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度下降，DHA和EPA含量減少，因而有必要進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇育種，篩選出生長(zhǎng)速度快

2、，DHA和EPA含量高的品系供養(yǎng)殖戶育苗使用。
　　為了更好地進(jìn)行球等鞭金藻的純化培養(yǎng)，首先需要進(jìn)行瓊脂固體培養(yǎng)基的優(yōu)化。采用3因素3水平的正交設(shè)計(jì)，研究了瓊脂濃度、培養(yǎng)基和氮源對(duì)球等鞭金藻固體平板生長(zhǎng)的影響，并且利用單因素優(yōu)化分析比較了維生素和抗生素對(duì)其藻落形成的影響。結(jié)果表明，瓊脂濃度可影響球等鞭金藻藻落的形成，球等鞭金藻（OA-3011）在0.6-1.0％瓊脂濃度的固體平板生長(zhǎng)最合適，而培養(yǎng)基和氮源對(duì)其影響較小，維生素 B1

3、和 B12對(duì)于其固體平板生長(zhǎng)不是必需的，抗生素對(duì)其固體培養(yǎng)有明顯抑制作用，建議在球等鞭金藻（OA-3011）固體平板分離、純化過(guò)程中，使用1%的瓊脂平板和不加維生素的F/2培養(yǎng)基。
　　目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用的大多數(shù)球等鞭金藻品系都來(lái)源于同一株藻Isochrysis galbanaOA-3011，經(jīng)過(guò)多年的地理隔離形成了不同的品系，為了揭示地理隔離對(duì)球等鞭金藻表型性狀的影響，從而為球等鞭金藻的選育工作提供依據(jù)，我們對(duì)5個(gè)品系的球等

4、鞭金藻（I.galbanaFACHB-861, OA3011-QD，OA3011-LK， OA3011-AY和OA3011-LZ）的種屬關(guān)系、生長(zhǎng)和脂肪酸組成進(jìn)行了比較分析。實(shí)驗(yàn)在相同條件下對(duì)5個(gè)品系球等鞭金藻培養(yǎng)6 d，提取基因組DNA并PCR擴(kuò)增測(cè)定18S rDNA基因序列，每天定時(shí)記錄各品系的OD660，繪制生長(zhǎng)曲線，在進(jìn)入穩(wěn)定期后收獲并進(jìn)行生物量的測(cè)定及脂肪酸的氣相色譜分析。18S rDNA基因序列的進(jìn)化分析表明，OA3011-

5、LK、OA3011-AY和 OA3011-LZ具有一致的序列，而OA3011-QD因1個(gè)堿基的差異與其它OA3011出現(xiàn)了分離，F(xiàn)AC HB-861與OA3011品系親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；對(duì)生長(zhǎng)和脂肪酸進(jìn)行對(duì)比分析后，結(jié)果顯示，5個(gè)品系的球等鞭金藻在不同的時(shí)間達(dá)到穩(wěn)定期，其中FACHB-861表現(xiàn)出了與其他品系明顯不同的生長(zhǎng)模式。FACHB-861和OA-3011品系的生物量具有顯著差異，OA3011-LK、OA3011-AY和OA3011-L

6、Z之間也有顯著差異（P＜0.05），但特異生長(zhǎng)率各品系間無(wú)顯著差異（P＜0.05）。 FACHB-861和OA3011-LZ的總脂肪酸（TFA）含量顯著低于OA3011-LK、OA3011-QD和OA3011-AY（P＜0.05）。 FACHB-861的脂肪酸各成分與OA-3011各品系明顯不同。然而，在OA-3011各品系間脂肪酸組成也有明顯差異，這表明球等鞭金藻存在廣泛和頻繁的數(shù)量性狀表型差異?？傊?，地理隔離造成的這些差異為球等鞭金

7、藻的選育提供了可行性。
　　選擇來(lái)自山東煙臺(tái)（OA3011-YT）以及海南省（OA3011-HN）的球等鞭金藻進(jìn)行膠群相細(xì)胞模擬雜交，OA3011-YT品系進(jìn)行膠群相模擬自交，利用優(yōu)化后的瓊脂平板涂布技術(shù)獲得單克隆并在F/2液體基中培養(yǎng)出F1代個(gè)體，作為模擬自交系F1及模擬雜交系F1，通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)、脂肪含量和脂肪酸組分篩選出優(yōu)勢(shì)藻株，對(duì)優(yōu)勢(shì)藻株進(jìn)一步進(jìn)行膠群相細(xì)胞雜交、自交，再重復(fù)上述步驟獲得模擬自交系和模擬雜交系的F2代優(yōu)勢(shì)

8、藻株，最后對(duì)F2代藻株進(jìn)行脂肪酸組分的分析。比較F1及F2代藻株脂肪酸組分后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)定向選育，F(xiàn)1代中DHA和EPA含量較高的藻株在F2代中得到了保留，并且F2代最低DHA、EPA、PUFA含量水平得到了提高；模擬雜交系在生長(zhǎng)、脂肪酸含量以及提高 D HA、P UFA含量的能力上均優(yōu)于模擬自交系，最終篩選獲得4株DH A含量高并且生長(zhǎng)速度快的藻株，以及2株EPA含量高并且生長(zhǎng)速度快的藻株進(jìn)行保種，未來(lái)將對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)、研究和利用