AGEs-Cyr61信號通路在糖尿病小鼠激光誘導脈絡膜新生血管生成中的作用及其機制.pdf

1、【研究背景】脈絡膜新生血管（CNV）至少與40余種眼部疾病相關，常見于年齡相關性黃斑病變（AMD）、病理性近視黃斑變性、特發(fā)性CNV、眼組織胞漿菌病綜合征以及眼外傷等，其中AMD是發(fā)達國家老年人視力喪失的首要原因。上述嚴重威脅視功能的脈絡膜視網(wǎng)膜疾病具有共同的病理學特征，即CNV形成。因此，闡明CNV發(fā)生機理和臨床防治策略已然成為近年來眼科學領域的研究熱點和難點之一。
　　目前，已證實CNV發(fā)生的危險因素主要包括年齡、吸煙、遺傳及

2、心血管疾病等，而糖尿病作為心血管疾病明確的誘因，其與CNV發(fā)生的相關性研究已逐漸受到學者們關注。目前，臨床流行病學調查是針對上述疾病開展的主要研究形式；然而，深入系統(tǒng)的基礎理論研究尚缺乏，糖尿病影響CNV發(fā)生的分子機制仍不清楚。
　　前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，高血糖對CNV發(fā)生、發(fā)展具有十分重要的作用，主要證據(jù)包括：①糖尿病可加重鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病小鼠實驗性CNV的嚴重程度；②給予糖尿病小鼠抗氧化劑治療可明顯緩解其氧化損傷

3、程度，從而阻斷與血管新生相關的細胞信號通路，導致下游細胞因子的分泌量減少，降低CNV生成風險；③高血糖增加RPE細胞氧化應激水平，進而上調VEGF的表達；④高血糖可通過上調 RPE細胞中 VEGF的表達促進骨髓來源的間充質干細胞趨化至CNV區(qū)域并參與血管發(fā)生，從而加劇CNV的嚴重程度。
　　富半胱氨酸61（Cyr61）作為一種十分重要的細胞基質調節(jié)因子，在細胞的增殖、粘附、侵襲與轉移以及血管生成、炎癥發(fā)生和組織重塑等重要生理、病理

4、過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，其是利用 Agilent Mouse基因表達譜芯片對CNV小鼠及糖尿病條件下CNV小鼠RPE-脈絡膜-鞏膜復合體進行差異分析獲得的基因。Cyr61及其介導的信號通路是否參與CNV的生成，其中具體的分子機制是什么？對于上述問題的回答必將為CNV的防治提供新的策略。
　　【目的】索AGEs-Cyr61信號通路對糖尿病小鼠激光誘導CNV形成的調節(jié)作用及具體分子機理，為 CNV的臨床防治開拓新的靶點奠定理論基礎。

5、
　　【方法】
　　一、Cyr61在糖尿病模型小鼠CNV生成中的表達狀態(tài)分析
　?。?）實驗分組：將 C57BL/6J小鼠隨機分為三組：正常對照組、糖尿病組及糖尿病+氨基胍治療組，每組20只；（2）動物模型：腹腔連續(xù)5 d注射STZ構建小鼠糖尿病模型，模型構建成功2 w后，應用532 nm倍頻激光誘導CNV生成；激光光凝后14 d：（3）脈絡膜鋪片：將RPE-脈絡膜-鞏膜復合體鋪展進行血管染色，通過脈絡膜鋪片血管染色，

6、三維重建比較各組CNV體積；（4）組織病理學檢查：通過HE染色觀察各組CNV的高度和厚度差異；（5）組織免疫熒光染色：制備冰凍切片，抗體標記脈絡膜組織，分析Cyr61與VEGF的表達定位情況；（6）ELISA實驗：檢測脈絡膜組織中Cyr61和VEGF分泌量。
　　二、Cyr61對糖尿病小鼠CNV生成的影響
　?。?）實驗分組：將 C57BL/6J小鼠隨機分為三組——正常對照組、糖尿病組及糖尿病+Cyr61單克隆抗體治療組，每

7、組20只；（2）動物模型：腹腔連續(xù)5 d注射STZ構建小鼠糖尿病模型，模型構建成功2 w后，應用532 nm倍頻激光誘導CNV生成；激光光凝后14 d：（3）脈絡膜鋪片：將RPE-脈絡膜-鞏膜復合體鋪展進行血管染色，通過脈絡膜鋪片血管染色，三維重建比較各組CNV體積；（4）組織病理學檢查：通過HE染色觀察各組CNV的高度和厚度差異；（5）組織免疫熒光染色：制備冰凍切片，抗體標記脈絡膜組織，分析Cyr61與VEGF的表達定位情況；（6）E

8、LISA實驗：檢測脈絡膜組織中Cyr61和VEGF分泌量；（7）體外細胞行為學實驗：建立RPE細胞與CEC細胞共培養(yǎng)體系，分別使用MTT、Transwell和管腔形成實驗檢測基因沉默RPE細胞中Cyr61表達后，CEC細胞活力、移行數(shù)量和管腔形成長度；
　　三、AGEs對Cyr61的表達調控及其分子機制
　　（1）實驗分組：以RPE為細胞模型，分為六組——正常對照組、高糖處理組、10μg/mL BSA-AGEs處理組、50μ

9、g/mL BSA-AGEs處理組、100μg/mL BSA-AGEs處理組和sRAGE處理組；（2）Real-time PCR實驗：給予各處理組作用后，觀察Cyr61 mRNA表達水平變化；（3）Western-blot：給予各處理組作用后，檢測Cyr61、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、Stat3h和p-Stat3等蛋白表達水平變化；（4）雙熒光素酶報告基因：轉染pCMV-Stat質粒，分析Cy

10、r61轉錄活性情況；（5）ChIP實驗：細胞經(jīng)甲醛交聯(lián)、超聲破碎、免疫共沉淀和RT-PCR后，行瓊脂糖凝膠電泳比較條帶明暗程度。
　　四、Cyr61對VEGF的表達調控及其分子機制
　?。?）細胞模型：原代培養(yǎng)CEC細胞，將其作為后續(xù)實驗研究對象；（2）RT-PCR實驗：40 ng/mL重組Cyr61作用細胞0、30、60、90、120 min，觀察VEGF mRNA表達水平變化；（3）Western-blot：給予各處理組

11、作用后，檢測VEGF、FAK、p-FAK、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKK、p-IKK、IκB、MMP2和MMP13等蛋白表達水平變化；（4）細胞免疫熒光：采用激光共聚焦顯微鏡，觀察NF-κB細胞內定位情況變化。
　　【結果】
　　一、Cyr61在糖尿病模型小鼠CNV生成中的表達狀態(tài)分析
　　（1）AGEs抑制劑氨基胍可緩解糖尿病小鼠CNV生成的嚴重程度：光凝后14d， STZ誘導的糖尿病小鼠RPE層

12、和Bruch膜出現(xiàn)破裂，RPE細胞有較明顯增殖和遷移，新生血管增多，較正常小鼠 CNV體積顯著增大，而給予氨基胍治療，糖尿病小鼠CNV生成量明顯減少，CNV的厚度和高度顯著降低；（2）阻斷AGEs形成可下調Cyr61和VEGF的表達：糖尿病小鼠CNV區(qū)域Cyr61和VEGF呈高表達狀態(tài)，氨基胍不僅可抑制AGEs的形成，還可降低糖尿病小鼠眼部Cyr61及VEGF的分泌量。
　　二、Cyr61對糖尿病小鼠CNV生成的影響
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13、1）Cyr61單克隆抗體可降低糖尿病小鼠CNV生成的嚴重程度：光凝后14d， STZ誘導的糖尿病小鼠RPE層和Bruch膜出現(xiàn)破裂，RPE細胞有較明顯增殖和遷移，新生血管增多，較正常小鼠CNV體積顯著增大，而給予Cyr61單克隆抗體治療，糖尿病小鼠 CNV生成量明顯減少，CNV的厚度和高度顯著降低；（2）特異性阻斷Cyr61可減少Cyr61和VEGF的表達量：糖尿病小鼠CNV區(qū)域Cyr61和VEGF呈高表達狀態(tài)，玻璃體腔注射Cyr61單

14、克隆抗體可顯著性降低糖尿病小鼠眼部Cyr61及VEGF的分泌量；（3）基因沉默Cyr61表達能夠顯著性抑制CEC細胞增生、移行和管腔形成：與 AGEs處理組相比，腺病毒感染組 CEC細胞增殖率下降32％、細胞遷移數(shù)量降低67%、管腔形成長度減少29%。
　　三、AGEs對Cyr61的表達調控及其分子機制
　?。?）AGEs通過與受體RAGE結合調控Cyr61的表達：隨著AGEs刺激濃度增加，Cyr61表達水平逐漸升高，而游離

15、的 RAGE可抑制上述正相關效應；（2）JNK信號通路介導AGEs對Cyr61的表達調控：AGEs可促進MAPK信號通路相關蛋白ERK1/2、JNK和p38磷酸化，但僅阻斷 JNK信號通路可下調Cyr61的表達；（3） AGEs通過JNK信號通路促使轉錄因子Stat3活化：生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Cyr61啟動子區(qū)存在Stat3結合位點，阻斷JNK信號通路可顯著性逆轉AGEs致Stat3磷酸化水平升高；（4）轉錄因子Stat3增強Cyr61啟

16、動子區(qū)轉錄活性：轉錄因子Stat3與Cyr61基因轉錄起始位點上游-1351至-1333 bp啟動子區(qū)域結合，進而促進Cyr61的表達。
　　四、Cyr61對VEGF的表達調控及其分子機制
　　（1）Cyr61通過與整合素受體αVβ3結合調控VEGF表達：封閉整合素受體αVβ3可顯著性下調VEGF的表達，而封閉整合素受體αVβ5和α5β1，未見VEGF表達量有變化；（2）FAK-PI3K信號通路參與VEGF的表達調控：在重組

17、蛋白Cyr61的作用下， CEC細胞內 FAK-PI3K/AKT信號通路被激活，且上述信號通路參與調控 CEC細胞VEGF的表達；（3）Cyr61促進轉錄因子NF-kB細胞核轉位：Cyr61刺激組6 h，染色主要集中于細胞核內，細胞漿中較少；與Cyr61刺激組比較，F(xiàn)AK抑制劑作用6 h時，細胞漿染色較細胞核內深；（4）Cyr61促進基質金屬蛋白酶MMP2/MMP13的表達：與正常對照組相比，CEC細胞在Cyr61的作用下，MMP2、M

18、MP13表達量顯著升高（P＜0.01）。
　　【結論】AGEs可通過與RPE細胞表面受體RAGE結合，誘導轉錄因子Stat3活化，進而調控Cyr61的表達；Cyr61不僅可激活CEC細胞內整合素-PI3K/AKT信號，促進轉錄因子NF-κB核轉位上調VEGF，還對MMP2/MMP13具有重要的調控作用；抑制AGEs的形成或特異性阻斷Cyr61，能夠顯著性地抑制CEC細胞增生、移行和管腔形成，從而起到緩解糖尿病所致 CNV嚴重程度的