煙堿的提取工藝優(yōu)化及其殺蟲活性研究.pdf

1、煙堿有很強(qiáng)的內(nèi)吸活性、胃毒性和觸殺毒性，能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，對(duì)寄生蟲的乙酰膽堿受體有很強(qiáng)的親和性，使乙酰膽堿不能正常傳導(dǎo)、阻斷神經(jīng)、窒息死亡。現(xiàn)在對(duì)煙堿殺蟲劑的開發(fā)多見于植保領(lǐng)域，煙堿在水產(chǎn)上雖有悠久的應(yīng)用歷史，但是并無深入的研究。本文主要針對(duì)煙堿這一植物源殺蟲成分，考察了其有效的提取方式，以秀麗隱桿線蟲為模式生物探究了煙堿的體外殺蟲效果，并探究了煙堿的對(duì)小瓜蟲和指環(huán)蟲的殺滅作用及其對(duì)環(huán)境的影響。
　　1.為了篩選出最佳的

2、提取方式，比較了超臨界CO2萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法和索氏回流法這幾種提取方法對(duì)于煙堿的提取效率，發(fā)現(xiàn)提取效率最高的是超臨界CO2萃取法和酶輔助提取法。再從經(jīng)濟(jì)價(jià)值的角度進(jìn)行比較，酶輔助提取法較超臨界CO2萃取法更為操作簡(jiǎn)單，成本低廉，從提取成本角度更有價(jià)值，易于在工業(yè)生產(chǎn)上推廣。
　　2.以煙堿的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)酶解時(shí)間、酶解溫度，pH及提取時(shí)間4因素3水平的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用Design Expe

3、rt8.0.6分析軟件優(yōu)化酶輔助法提取煙堿的條件。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過響應(yīng)曲面分析來優(yōu)化廢棄煙葉的煙堿提取工藝，并得到回歸方程。試驗(yàn)首先考察了酶解時(shí)間、酶解溫度酶用量、pH等4組單因素水平對(duì)煙堿的影響，進(jìn)行了響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果表明，各影響因素對(duì)煙堿得率的影響程度大小依次為酶解溫度、酶解時(shí)間、酶用量、pH。優(yōu)選出最佳提取工藝結(jié)合實(shí)際為酶解時(shí)間2.00h，酶解溫度48.50℃，酶用量2.10％，pH4。根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，煙

4、堿提取得率平均值為3.320mg/g，與預(yù)測(cè)值相差較小。
　　3.本章選取秀麗隱桿線蟲作為煙堿體外殺蟲的模式生物，選擇運(yùn)動(dòng)行為、最長(zhǎng)壽命、生殖、個(gè)體發(fā)育、乙酰膽堿酯酶、細(xì)胞凋亡活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較研究了煙堿對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明煙堿暴露能夠引起壽命的減少，體長(zhǎng)的降低、運(yùn)動(dòng)行為的缺陷、子代數(shù)目的減少、細(xì)胞調(diào)亡水平的増加還能抑制乙酰膽堿酯酶的活性。
　　在實(shí)驗(yàn)濃度下，煙堿暴露對(duì)秀麗隱桿線蟲的壽命、體長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)行為水平

5、及子代目都能產(chǎn)生顯著的負(fù)面效應(yīng)，表明低濃度的煙堿暴露就能夠?qū)π沱愲[桿線蟲產(chǎn)生發(fā)育毒性、神經(jīng)行為毒性及生殖毒性。在實(shí)驗(yàn)濃度下，煙堿對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂褐素累積和ROS水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著的影響，表明實(shí)驗(yàn)濃度下煙堿的暴毒并不是通過氧化損傷途徑對(duì)秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生毒性效應(yīng)；
　　當(dāng)暴毒濃度達(dá)到0.25mg/ml時(shí)，秀麗隱桿線蟲的細(xì)胞調(diào)亡水平就有顯著地提高，與空白組相比，L4期幼蟲暴毒24h后秀麗隱桿線蟲在煙堿濃度為0.5mg/ml、1mg/m

6、l時(shí)即顯著降低(P＜0.05),煙堿濃度大于0.5mg/ml時(shí)就會(huì)對(duì)線蟲的細(xì)胞凋亡水平產(chǎn)生極顯著影響(P＜0.01)，煙堿暴毒對(duì)生理水平的影響可能與細(xì)胞調(diào)亡水平的提高有關(guān)。L1期幼蟲暴毒72h后秀麗隱桿線蟲在煙堿濃度為1mg/ml時(shí)即產(chǎn)生乙酰膽堿酯酶活性顯著降低(P＜0.05),煙堿濃度大于1.5mg/ml時(shí)就會(huì)對(duì)乙酰膽堿酯酶活性產(chǎn)生極顯著影響(P＜0.01)，說明煙堿主要是通過抑制乙酰膽堿酯酶活性擾亂神經(jīng)傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致線蟲的行為缺陷。

7、
　　4.煙堿對(duì)指環(huán)蟲和小瓜蟲有顯著的驅(qū)殺效果，在煙堿使用后，各實(shí)驗(yàn)組蟲體均有顯著減少，在作用的第二天就顯現(xiàn)出對(duì)寄生蟲的抑制作用，作用第6~7d，對(duì)寄生蟲表現(xiàn)出了良好的驅(qū)殺作用。在以柵列藻和銅綠微囊藻為非靶標(biāo)藻類衡量煙堿對(duì)水環(huán)境的影響中，發(fā)現(xiàn)煙堿對(duì)藻類的生長(zhǎng)呈抑制作用。
　　煙堿對(duì)藻類的抑制反映在對(duì)藻膽蛋白含量的影響上，能夠在一定程度上影響藻膽蛋白各組分的構(gòu)成來阻遏銅綠微囊藻的PSⅡ作用位點(diǎn)，從而抑制藻類的生長(zhǎng)。