蛋黃蛋白質(zhì)多肽的制備及其促成骨活性的研究.pdf

1、蛋黃中含有豐富的蛋白質(zhì)，通過蛋白酶水解制備得到蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(EYPH)，其中含有大量的生物活性功能物質(zhì)，據(jù)報道EYPH具有抗氧化、降血壓、與礦物結(jié)合等活性。本論文主要以制備EYPH為研究對象，首先通過篩選最適蛋白酶及優(yōu)化水解條件制備EYPH，進而研究EYPH對于成骨細胞MC3T3-E1分化及礦化的影響反應(yīng)其對骨礦化的影響，為開發(fā)促進骨骼生長的功能食品提高理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)論為:
　　對于骨生成細胞模型小鼠顱頂前成骨細

2、胞亞克隆14(MC3T3-E1)細胞進行培養(yǎng)。以4種蛋白酶水解蛋黃蛋白質(zhì)得到水解產(chǎn)物按不同濃度加入MC3T3-E1培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，檢測細胞增殖活力，發(fā)現(xiàn)了水解產(chǎn)物對MC3T3-E1細胞增殖活力促進效果與產(chǎn)物濃度無劑量關(guān)系，濃度過高對成骨細胞增殖促進作用降低。比較4種水解產(chǎn)物對MC3T3-E1細胞增殖的影響，最后得出胰蛋白酶制備的EYPH對成骨細胞增殖活力促進效果最好，細胞增殖活力為130.27％，其次為風(fēng)味蛋白酶制備的EYPH，細胞增殖

3、活力為123.69％。
　　將胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)了水解產(chǎn)物的水解度(DH)隨水解時間的增長而增大，DH高不一定產(chǎn)物活性強，水解6h時所得的水解產(chǎn)物對MC3T3-E1細胞增殖率促進效果最強，其水解度為18.6％。以MC3T3-E1細胞增殖活力為指標(biāo)對水解條件進行優(yōu)化，將兩種蛋白酶水解條件分別進行單因素實驗，后進行兩種酶復(fù)配的正交實驗，實驗發(fā)現(xiàn)單一的胰蛋白酶反應(yīng)得到水解產(chǎn)物活性最好，最佳的水解條件為:水解

4、時間6h、水解溫度37℃、酶與底物比1∶50、水解pH8.0。
　　胰蛋白酶在最佳水解條件下制備得EYPH，探究EYPH對MC3T3-E1細胞增殖、分化及礦化的影響進行研究。發(fā)現(xiàn)EYPH能夠有效促進MC3T3-E1細胞的增殖，在1 mg/mL濃度下細胞增殖效果最佳，細胞增殖活力最高為129.87％。在EYPH的刺激下，成骨細胞處于S期的細胞含量顯著增加，進一步說明EYPH可有效促進MC3T3-E1細胞的增殖。通過成骨細胞中ALP活

5、力測定，發(fā)現(xiàn)EYPH對成骨細胞分化有顯著促進作用，在刺激7d條件下，ALP活力提高9.1％。通過熒光定量RT-PCR測定MC3T3-E1細胞分化階段成骨相關(guān)基因(Runx2、ALP、OC)的表達量，進一步證實了EYPH對成骨細胞分化有顯著促進作用。采用茜蘇紅染色得到EYPH對成骨細胞礦化有促進作用，且1 mg/mL濃度組要優(yōu)于2mg/mL濃度組。從這一系列的結(jié)果可以推出EYPH擁有促骨生長活性。
　　通過Superdex pept

6、ides凝膠柱及超濾的方法對EYPH進行分離，比較不同組分對成骨細胞MC3T3-E1增殖及分化的影響。研究得到水解產(chǎn)物中對成骨細胞活性最強的物質(zhì)分子量在10-30kDa之間。經(jīng)氨基酸分析儀分析，對MC3T3-E1細胞增殖分化影響最大的組分中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸及精氨酸這8種氨基酸含量比水解產(chǎn)物組中的含量高。通過MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果顯示兩個組分中含有大量共有肽段，其中高豐度的共有肽段為 A