基于肽電荷反轉(zhuǎn)的智能熒光成像及抗腫瘤藥物遞送一體化納米探針的研究.pdf

1、研究目的:制備一種基于肽電荷反轉(zhuǎn)的智能靶向、可用于腫瘤熒光成像與抗腫瘤藥物遞送一體化的介孔二氧化硅納米探針(YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX)，進(jìn)行體外及體內(nèi)研究，以評(píng)估其靶向性成像效果及在治療中的作用。
　　研究方法:1.納米探針的制備及表征:制備YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針，用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)及激光散射粒度儀進(jìn)行表征;采用透析法測(cè)定納米探針的體外藥物釋放行為

2、，計(jì)算抗腫瘤藥物(鹽酸阿霉素，DOX)的包封率和載藥率;熒光顯微鏡下觀察YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針在不同pH值條件下的熒光;傅里葉紅外光譜儀測(cè)繪納米探針的紅外光譜曲線;熱重分析儀計(jì)算納米探針中各成分所占比重;利用比表面積和孔徑分布分析儀測(cè)量納米探針的比表面積和孔徑。2.納米探針的體外靶向性及細(xì)胞毒性研究:用制備的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針?lè)謩e與MCF-7細(xì)胞和HEK293細(xì)

3、胞共同孵育，用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，共聚焦激光顯微鏡(CLSM)觀察納米探針的細(xì)胞攝取。3.納米探針在體成像及療效研究:建立MCF-7裸鼠乳腺癌移植瘤模型，分為治療組及成像組。治療組分為四組，每次治療前測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)與寬，稱量裸鼠體重。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，取血20μL進(jìn)行血常規(guī)檢查，然后將裸鼠處死，離體腫瘤及臟器，進(jìn)行組織病理HE染色;腫瘤組織予TUNEL及CD31免疫組化檢測(cè)。成像組分為三組，利用近紅外熒光成像儀

4、進(jìn)行荷瘤鼠活體及離體腫瘤、器官熒光成像。
　　研究結(jié)果:1.納米探針的制備及表征:制備的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針呈球形，粒徑約50nm。DOX的載藥量為8.6±1.4％，包封率為39.3±3.5％。在pH5.0的PBS中，納米探針中的DOX釋放速度最快，10小時(shí)釋放約34.5±3.6％，與在pH6.5PBS中的釋放19.7±2.4％比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05），與pH7.4PBS中釋放1

5、0.5±2.1％比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。熒光顯微鏡下觀察顯示，YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針在中性PBS液(pH7.4)中熒光很弱，熒光強(qiáng)度比值為15.7±3.8％，在堿性PBS液(pH8.0)中未觀察到熒光，熒光強(qiáng)度比值為7.3±1.8％，而在酸性PBS液(pH5.5及6.5)中，觀察到明顯的綠色熒光，熒光強(qiáng)度比值分別為74.3±10.5％％和56.8±8.7％。熱重分析檢測(cè)結(jié)果顯示CPTS

6、、TAT-FITC、Cit、YSA-BHQ1、DOX在YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針中所占重量比例分別為7.2±2.4％、14.4±4.1％、6.7±1.9％、14.6±4.5％、8.2±2.7％。YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針的比表面積、介孔容積和介孔直徑分別為157.4±23.1m2/g、0.27±0.07mL/g和0.7±0.15nm，較MSN的比表面積496.7±56.4m

7、2/g、介孔容積0.98±0.24mL/g和介孔直徑2.2±0.8nm均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。2.納米探針的體外靶向性及細(xì)胞毒性研究:CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOX濃度為0.1μg/mL的YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX納米探針作用于MCF-7細(xì)胞的存活率為69.7±9.8％，游離DOX組為80.5±8.3％，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05），且細(xì)胞活性隨DOX濃度增加逐漸減小，呈濃度依賴性

8、。DOX濃度為0.1μg/mL的YSA-BHQ1/TAF-FITC/MSN@DOX納米探針作用于HEK293細(xì)胞的存活率為96.5±11.8％，游離DOX組為78.1±9.6％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05），細(xì)胞活性隨DOX濃度增加逐漸減小，呈濃度依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX組納米探針引起MCF-7細(xì)胞凋亡的比例為51.8±9.2％，高于游離DOX組的41.2±8.4％，

9、兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);引起HEK293細(xì)胞凋亡的比例為11.3±1.8％，與游離DOX組39.3±6.5％比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。納米探針細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX和游離DOX進(jìn)入MCF-7細(xì)胞內(nèi)的量均較多。YSA-BHQ1/TAT-FITC/MSN@DOX進(jìn)入HEK293細(xì)胞和經(jīng)過(guò)YSA肽預(yù)處理的MCF-7細(xì)胞內(nèi)的量均很少。3.納米探針在體成像及療效研究:荷

10、MCF-7細(xì)胞瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)顯示，YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制作用優(yōu)于游離DOX組，治療21天后，腫瘤體積為412.7±73.5mm3，腫瘤重量為0.35±0.09g，游離DOX組腫瘤體積為578.4±40.7mm3，腫瘤重量為0.58±0.16g，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。治療21天后，YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組裸鼠體重為27.4±8.6g，游離DOX

11、組裸鼠體重為18.5±4.3g，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組血白細(xì)胞數(shù)為7.5±1.8×109/L，游離DOX組血白細(xì)胞數(shù)為4.2±1.7×109/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組裸鼠器官組織病理HE染色未觀察到明顯組織損傷。近紅外成像結(jié)果顯示YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX納米探針

12、經(jīng)裸鼠尾靜脈注射后沒(méi)有在尾部顯影，在注射后1小時(shí)開始在腫瘤部位顯影，YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/M SN@D OX組腫瘤/正常組織熒光強(qiáng)度比值(T/N)為3.13±0.74，與TAT-Cy5.5/MSN@DOX組1.73±0.57及游離Cy5.5組1.64±0.48比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。注射后12小時(shí)，YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組腫瘤/正常組織T/N為4.06±0.88，與TAT-

13、Cy5.5/MSN@DOX組0.97±0.28及游離Cy5.5組0.82±0.21比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01）。注射后24小時(shí)，YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組腫瘤部位熒光亮度達(dá)到高峰，YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組腫瘤/正常組織T/N為4.93±0.79，與TAT-Cy5.5/MSN@DOX組1.06±0.25及游離Cy5.5組1.38±0.31比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0

14、.01)。第48小時(shí)YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX組腫瘤/正常組織T/N為4.01±0.59，與TAT-Cy5.5/MSN@DOX組1.04±0.28及游離Cy5.5組1.82±0.45比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　研究結(jié)論:成功制備了一種可用于腫瘤熒光成像與抗腫瘤藥物遞送一體化的介孔二氧化硅納米探針(YSA-BHQ1/TAT-FITC(Cy5.5)/MSN@DOX)。該納米探針能通過(guò)Eph

15、A2受體介導(dǎo)的途徑大量進(jìn)入MCF-7細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡;而對(duì)HEK293細(xì)胞毒性作用較小。標(biāo)記有Cy5.5的納米探針YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX能特異性地靶向MCF-7腫瘤，并且在裸鼠腫瘤部位長(zhǎng)時(shí)間滯留，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，而對(duì)正常器官組織毒副作用較小。YSA-BHQ1/TAT-Cy5.5/MSN@DOX納米探針經(jīng)裸鼠尾靜脈注射后在正常組織和血液循環(huán)中熒光背景極低，在腫瘤部位熒光較強(qiáng)，可獲得最大的腫瘤/正