雙孢蘑菇多糖的提取分離及其免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一種常見的食用真菌，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等多種成分，具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等?，F(xiàn)代研究表明，多糖在雙孢蘑菇發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性方面具重要意義，但其作用機理尚待進一步研究。本論文綜合采用多種色譜技術(shù)制備雙孢蘑菇多糖，并結(jié)合多種分析手段對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，以小鼠單核巨噬細胞RAW264.7為細胞模型，通過考察RAW264.7細胞的增殖、NO釋放、COX蛋白表達、炎癥相

2、關(guān)因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表達以及相關(guān)蛋白水平的調(diào)控，探究雙孢蘑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)作用機制，以期為雙孢蘑菇多糖的開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。主要研究成果如下：
　?。?）微波輔助熱水浸提法提取雙孢蘑菇粗多糖，并通過AB-8大孔吸附樹脂脫色素，D201離子交換樹脂脫蛋白質(zhì)，SephacrylTM S-300凝膠柱層析獲得分子質(zhì)量均一的雙孢蘑菇多糖樣品。采用苯酚-硫酸法測得雙孢蘑菇多糖含量為99.2％（以葡萄

3、糖計）。采用排阻色譜法，利用葡聚糖標準品的保留時間與標準分子量繪制標準曲線，測得雙孢蘑菇多糖的分子量為822KDa。
　　（2）HPLC柱前衍生化法測得該多糖的主要單糖組成為甘露糖（含量28.26%）、葡萄糖（含量20.88%）、半乳糖（含量27.82%）和少量木糖（含量9.87%）。紅外光譜顯示雙孢蘑菇多糖具有多種多糖的特征吸收峰，1035.82 cm-1和886.57c m-1特征吸收峰顯示該多糖主要為β-吡喃型多糖。核磁共振

4、波譜（1H-NMR）顯示該多糖主要由β-吡喃糖組成，并含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖各單糖殘基的特征吸收峰，這與紅外光譜分析和單糖組成分析結(jié)果一致。
　?。?）MTT試驗表明，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細胞12 h后，低濃度（1μg·mL-1）的雙孢蘑菇多糖可以顯著促進RAW264.7細胞的增殖，高濃度（10μg·mL-1）的雙孢蘑菇多糖能夠顯著抑制RAW264.7細胞的增殖?？傮w而言，當濃度逐漸升高時雙孢蘑菇多糖對RA

5、W264.7細胞的增殖作用呈現(xiàn)出由促進逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐种频内厔荨?br>　?。?）Griess試驗和Western Blot試驗表明，不同濃度的雙孢蘑菇多糖作用RAW264.7細胞12 h后，1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1該多糖可以顯著促進RAW264.7細胞中NO釋放和壓力反應(yīng)蛋白（iNOS和COX-2）表達量的增加，且具有一定的劑量依賴性，初步表明該多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。RT-PCR試驗和瓊脂糖凝膠電泳試驗

6、顯示，不同濃度的雙孢蘑菇多糖作用RAW264.7細胞12 h后，1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1的該多糖均能夠顯著促進IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2 mRNA的表達（relative toβ-actin），且具有一定的劑量依賴性，進一步說明了雙孢蘑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。另外，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細胞后，能夠顯著促進IκB-α和ERK蛋白的磷酸化水平，激活I(lǐng)κB/NF-κB和ERK/MAP

7、K;通路，表明該多糖能夠通過激活 RAW264.7細胞中的IκB/NF-κB信號通路和ERK/MAPK信號通路調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，從而起到相應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用。
　?。?）Western Blot試驗顯示，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細胞12 h后，1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1雙孢蘑菇多糖均能夠誘導 RAW264.7細胞中caspase-3的激活，且隨著濃度的增加，Cleaved caspase-3的表

8、達量增加，具有一定的劑量依賴性，表明雙孢蘑菇多糖可以誘導RAW264.7細胞的凋亡作用。同時，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細胞后，能夠在15-90 min內(nèi)顯著誘導JNK蛋白的磷酸化，從而激活JNK/MAPK信號通路。另外，雙孢蘑菇多糖作用于RAW264.7細胞12 h后，5μg·mL-1和10μg·mL-1雙孢蘑菇多糖能夠顯著抑制RAW264.7細胞中Bcl-2蛋白的表達；1μg·mL-1、5μg·mL-1和10μg·mL-1雙

9、孢蘑菇多糖能夠顯著促進Bim蛋白的表達，且Bim蛋白的表達主要是由JNK/MAPK通路的激活誘導產(chǎn)生。上述結(jié)果表明，雙孢蘑菇多糖能夠通過誘導RAW264.7細胞中JNK/MAPK通路的激活誘導細胞凋亡作用，且主要是經(jīng)過Bc l-2和B im蛋白的共同介導誘導細胞凋亡作用。
　　綜上所述，雙孢蘑菇多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性，可以作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，具有較為廣闊的開發(fā)前景。雙孢蘑菇多糖在促進RAW264.7細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的