木霉誘導(dǎo)黃瓜對枯萎病的抗性機制及相關(guān)miRNA分析.pdf

1、黃瓜枯萎病是黃瓜生產(chǎn)中發(fā)病較重的土傳病害，主要以土壤為傳播媒介，防治難度大。木霉對多種病原菌引起的土傳病害具有較好的防治效果。植物miRNA通過轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達，來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和應(yīng)答各種非生物脅迫。目前木霉誘導(dǎo)的黃瓜枯萎病抗性機制尤其是 miRNA在其中的作用尚不明確。本研究首先篩選了對枯萎病菌拮抗作用較強的木霉菌株，分析了木霉菌通過調(diào)控活性氧(ROS)和對根系細胞周期影響從而提高對黃瓜枯萎病的拮抗機制，最后對木霉誘導(dǎo)的miR

2、NA進行了分析。結(jié)果如下：
　　1．采用平板對峙法，利用T11、T22、T24、TM、T28、T1546株木霉，篩選得到對黃瓜枯萎病具有較高拮抗活性的木霉 TM，其抑菌率為78.05％，經(jīng)測定，木霉TM易揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對枯萎病菌抑制率達72.5%，難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對枯萎病菌抑制率為61.73%。
　　2．分析了預(yù)接種木霉對枯萎病菌侵染的黃瓜根系中的ROS含量的影響，與對照相比，預(yù)接種木霉黃瓜根中的H2O2含量增加了39.49

3、％；只接種枯萎病菌的黃瓜根中H2O2和O2-含量顯著增高，分別比對照植物高3.55倍和8.10倍。而先預(yù)接種木霉然后再侵染枯萎病菌的處理，根中 H2O2和 O2-含量明顯降低，比只用枯萎病菌處理降低53.92％和57.31％。
　　3．為分析細胞周期調(diào)節(jié)在木霉提高枯萎病抗性中的作用機制，測定了6個細胞周期相關(guān)基因在黃瓜根系中的表達。接種枯萎病菌導(dǎo)致黃瓜根系細胞死亡，細胞周期相關(guān)的基因表達水平均明顯降低，而先接種木霉的處理則誘導(dǎo)了與

4、細胞周期相關(guān)基因的顯著上調(diào)。與只接種枯萎病菌相比， CDKA、CDKB、CycA、CycB、CycD3;1和 CycD3;2的表達水平分別增加2.39、3.58、7.65、5.81、1.98和3.43倍，表明木霉接種可以誘導(dǎo)與細胞周期相關(guān)的基因明顯上調(diào)，從而提高了根系細胞生活力。
　　4．構(gòu)建黃瓜小RNA文庫，并利用Solexa測序技術(shù)對小RNA文庫進行測序分析。結(jié)果表明，對照處理、接種枯萎病菌處理、先接種木霉再接種枯萎病菌處理、

5、接種木霉處理分別獲得了63781366條、52040096條、54159164條和42093177條的純凈測序 reads。總共篩選出92個已知 miRNA，預(yù)測到63個新miRNA。與對照相比，枯萎病侵染處理的黃瓜根系中有62個 miRNA表達發(fā)生顯著變化；將先接種木霉再接種枯萎病菌處理與只接種枯萎病菌處理進行比較分析發(fā)現(xiàn)，有60個 miRNA發(fā)生了顯著性變化。堿基分布統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，四個小RNA文庫中在植物中含量較多的長度為21

6、nt和22 nt的新miRNA序列首位點堿基 U所占比例較大；在序列堿基11位點，四個樣品的新 miRNA序列的堿基都偏向于 A，符合 miRNA序列特征，說明新 miRNA序列的預(yù)測結(jié)果可行性高。針對篩選出的9個差異表達的已知miRNA，利用qRT-PCR對其表達結(jié)果進行測序結(jié)果驗證，相符率達到了94.2%，表明測序結(jié)果可靠性較高。
　　本實驗對枯萎病菌進行了分子鑒定，篩選出拮抗作用較強的木霉菌株 TM，研究了枯萎病侵染的情況下