粘細菌的環(huán)境分布、季節(jié)演替及其相互作用.pdf

1、粘細菌(myxobacteria)是一類能夠滑動運動的革蘭氏陰性桿菌，在系統(tǒng)進化上對應(yīng)變形菌門、δ變形菌綱的粘球菌目（Myxococcales），分為3個亞目，23個屬和50多個種。粘細菌能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，被公認(rèn)為是繼放線菌之后的又一個重要的藥源微生物新類群;因其具有復(fù)雜的多細胞群體行為和能形成多細胞聚集、形態(tài)特異的子實體結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是“社會性的細菌”。
　　粘細菌曾被認(rèn)為是一類典型的土壤微生物，近年來淺海水域分離得到嗜

2、鹽和耐鹽菌株;分子生態(tài)學(xué)研究表明在海洋不同深度、不同位置的沉積物中均有粘細菌分布。此外，一些文獻報道了湖泊河流中粘細菌的分離純化，但這些菌株在形態(tài)上與陸地粘細菌高度相似，長期以來人們普遍認(rèn)為水流或風(fēng)力把陸地粘細菌的子實體帶入淡水環(huán)境，淡水生境只是粘細菌的“暫居地”。因此，淡水環(huán)境是否為粘細菌的重要生境依然不清晰。
　　我們在程海湖采集沉積物樣品，進行菌株分離純化，共獲得113株粘細菌，絕大多數(shù)菌株隸屬于Myxococcus、Sor

3、angium和Nannocystis，與分離自土壤的典型菌株形態(tài)高度相似，且16SrRNA基因的差距在2％以內(nèi);其中三株菌位于進化樹的獨立分支，與Cystobactergracilis的相似性在92.2％與97.5％之間，可能屬于新的種屬。使用試劑盒提取1.0g沉積物的總DNA，并分兩步對沉積物中的細菌群落進行454高通量測序。首先，使用兩對通用細菌引物分別擴增16SrRNA基因的V3-V4高變區(qū)和V6-V8高變區(qū)，構(gòu)建通用細菌文庫UV

4、34和UV678，分別獲得25305和30604條高質(zhì)量序列，包括2546和5559個種(以0.03的差異水平劃分OTU)。粘細菌是沉積物細菌群落中的主要種群，占據(jù)序列數(shù)量的5.77％（在目的水平據(jù)第三位;兩個文庫中分別為7.25％和4.29％）和種類的7.52％（據(jù)第一位;兩個文庫中分別為9.62％和5.41％）;粘細菌中較多的幾個屬是Archangium(16.63％)、Anaeromyxobacter(9.14％)、Kofleri

5、a(8.77％)、Chondromyces(4.45％)和Phaselicystis(4.15％)，其他屬均低于3％。然后，分別使用Cystobacterineae和Sorangineae特異引物構(gòu)建粘細菌的特異文庫CV34和SV678，Cystobacterineae中較多的幾個屬是Anaeromyxobacter、Cystobacter和Corallococcus;Sorangineae中較多的屬是Byssovorax、Sorang

6、ium和Phaselicystis。
　　隨后，我們調(diào)查了公開發(fā)表的高通量測序數(shù)據(jù)，在三個研究共39組普通淡水沉積物樣品中(290658條細菌序列)，粘細菌普遍存在，平均數(shù)量比例為(3.73±2.84)％，但不同樣品中粘細菌的內(nèi)部分類單元組成差距較大;在普通淡水水體和溫泉環(huán)境中，粘細菌的比例則很低(＜0.3％)。這些結(jié)果表明普通淡水沉積物是粘細菌的重要生境。土壤、海洋和淡水粘細菌的系統(tǒng)發(fā)育比較分析顯示，陸地、海洋粘細菌在高分類水平

7、（科）分離，即使在同一個分支，海洋粘細菌和陸地粘細菌的序列差異一般也比較大;淡水環(huán)境粘細菌一般和陸地粘細菌處于相同分支，與陸地序列親緣關(guān)系近于海洋序列，但仍有部分序列形成了獨立于陸地、海洋粘細菌的特有分支（特有的分類單元）。
　　另一方面，粘細菌在土壤生境中分布廣泛，但因其捕食特征和多細胞群體行為，而被認(rèn)為是一類數(shù)量偏少的種群。一個常規(guī)土壤樣品(SDU)的宏基因組測序顯示，粘細菌在數(shù)量和種類上分別占4.10％和7.75％，是優(yōu)勢菌

8、群。為深入理解粘細菌多樣性的橫向范疇（環(huán)境分布）和縱向范疇（季節(jié)演替），我們詳細考察了公共數(shù)據(jù)庫各類生境中粘細菌的存在及數(shù)量比例。在森林、草地、農(nóng)田等普通土壤中（525組數(shù)據(jù)，6776656條細菌序列），粘細菌在細菌群落中的比例約為（3.01±2.35）％;在海灘泥沙、極地的苔原冰川沙漠等非典型的土壤環(huán)境，粘細菌的平均數(shù)量比例也在1％以上;在普通淡水環(huán)境沉積物中，粘細菌分布廣泛且數(shù)量較多(3.73％);普通淡水水體中粘細菌分布較為普遍，

9、存在于85.8％的樣品，但數(shù)量比例較低，僅為0.23％;在溫泉及海洋環(huán)境中，粘細菌數(shù)量一般小于0.2％，且存在不具有普遍性(26.7％-68.5％)。
　　分析全球各地320組有采樣時間記錄的土壤樣品，其中粘細菌的平均比例為3.41％（粘細菌數(shù)目與細菌數(shù)目的Pearson相關(guān)性分析，R2=0.6827，F(xiàn)檢驗P＜0.001）。在不考慮樣品之間差異的情況下，粘細菌的比例似乎有隨季節(jié)周期性變化的趨勢，在春季（3-5月）和秋季（9-11

10、月）較多，而夏季和冬季則減少。選擇一組對樣品進行連續(xù)監(jiān)測（5，6，7，8，10，11六個月）的測序數(shù)據(jù)（凱洛格生物站測序樣品），其中粘細菌的平均比例為（2.27±0.69）％，在目的水平據(jù)第8位。三種土壤類型中粘細菌都有8月份數(shù)量、種類減少的趨勢;這與整個細菌群落多樣性（以Faith'sphylogeneticdiversity作為指標(biāo)）以及其他捕食性細菌的變化趨勢均不相同。粘細菌的波動幅度最小，且數(shù)量維持在穩(wěn)定的較高水平(1.2％-3

11、.2％)。三種土壤類型的細菌群落多樣性幾乎都與土壤濕度和溫度顯著相關(guān)，而環(huán)境參數(shù)對各類捕食性細菌的數(shù)量比例影響均不明顯;推測環(huán)境因素對微生物群落的影響并非具體到每一個類群，粘細菌的數(shù)量變化是多種環(huán)境參數(shù)、甚至生物因素綜合作用的結(jié)果，而每種參數(shù)對其影響都不是線性的，需要結(jié)合實際情況進行分析:8月份樣品采集前持續(xù)的高溫干燥導(dǎo)致了粘細菌進入休眠狀態(tài)，即形成子實體，期間大量的細胞(60-90％)發(fā)生程序性死亡致使粘細菌數(shù)量顯著下降;之后經(jīng)過幾次

12、降水，土壤濕度回升，10月份（秋季）樣品中粘細菌數(shù)量比例上調(diào);到了11月份，低溫（促使粘細菌以形成子實體的形式休眠）逐漸成為限制因素，其數(shù)量增長變慢甚至略有下降。土壤類型對粘細菌的影響可能表現(xiàn)在最大值出現(xiàn)時間、數(shù)值波動幅度等方面。統(tǒng)計各樣品的粘細菌內(nèi)部組成并進行聚類分析，樣品沒有因土壤類型或采集時間聚集，說明粘細菌的內(nèi)部組成也是多種因素（土壤類型、采集時間、各種環(huán)境參數(shù)、生物因素等）綜合作用的結(jié)果。粘細菌各科隨季節(jié)的變化趨勢各不相同，甚

13、至有此消彼長的趨勢，暗示了粘細菌群落中各分類單元具有差異性，存在著種間相互作用。
　　產(chǎn)自纖維堆囊菌的大環(huán)內(nèi)酯類化合物埃博霉素(Epothilones)，是一種作用機理類似紫杉醇的抗腫瘤藥物，目前已有結(jié)構(gòu)類似物商品化上市。相對于埃博霉素需求的日趨增長，通過纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的埃博霉素產(chǎn)量極低成為其價格高昂的主要原因。埃博霉素產(chǎn)生菌只占分離菌株數(shù)目的2.5％，是相對稀缺的資源菌株;纖維堆囊菌生長緩慢，遺傳操作困難，而異源表達埃博霉素

14、的產(chǎn)量經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后仍然很低。因此，我們采取了菌株改良與發(fā)酵優(yōu)化外的兩種策略:尋找更多的埃博霉素產(chǎn)生菌，以期分離到具有優(yōu)良性狀的菌株，用于后續(xù)的基因操作，還可以對比研究埃博霉素的合成機制;利用纖維堆囊菌的共培養(yǎng)，驗證種內(nèi)相互作用是否像種間相互作用一樣影響（提高）次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　結(jié)合前期工作中獲得的菌株，我們發(fā)現(xiàn)相對于未知土壤的低埃博霉素陽性菌株比例(2.5％)，在陽性土壤中進行菌株二次分離，可以獲得較多的埃博霉素產(chǎn)生菌(

15、25％-75％);在一個陽性土壤附近10平方千米內(nèi)的幾個土樣中，陽性菌株的比例也較高(27.3％)。分析一個陽性菌株(So0157-2)的基因組發(fā)現(xiàn)，埃博霉素基因簇連同上下游共計128kb的區(qū)段可能來自水平基因轉(zhuǎn)移。對比三株菌的埃博霉素全基因簇，其相似性約為98.5％;埃博霉素基因簇中的酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域顯著區(qū)別于其他來源（非纖維堆囊菌或纖維堆囊菌中其他基因）的AT;在4個已報道埃博霉素基因簇的纖維堆囊菌中，同一模塊中的AT蛋白序

16、列差異水平都小于3.2％;14株纖維堆堆囊菌的ATModC2（epoC模塊的第2個AT結(jié)構(gòu)域）的蛋白序列的最大差異約為5.8％。這說明了埃博霉素基因簇的高度保守與相對多樣。單個樣品中獲得的16SrRNA基因序列最大差異約為3.1％，與不同土壤來源的菌株序列差異相當(dāng)，而埃博霉素產(chǎn)量更是相差2000倍以上，這說明了單一樣品中纖維堆囊菌的多樣化。對于遺傳操作復(fù)雜的微生物，尋找更多的陽性菌株是一種可供選擇的簡明有效策略。
　　在兩個不同土

17、樣各選擇6株纖維堆囊菌（產(chǎn)生埃博霉素或不產(chǎn)生埃博霉素）進行共培養(yǎng)的影響研究。菌株之間在生長上均呈現(xiàn)明顯的相互抑制，雙方生長變?nèi)?，生物量低于純培養(yǎng)物對照（兩個純培養(yǎng)物生物量之和）的35％，推測由空間和營養(yǎng)的爭奪所致。共培養(yǎng)大大影響了埃博霉素產(chǎn)量，45個組合平均提高倍數(shù)為2.45±3.25;33個組合的產(chǎn)量顯著改變（提高或降低倍數(shù)在50％以上）;29個(64.4％)組合產(chǎn)量提高，最大提高倍數(shù)為10.4。熒光定量PCR顯示，共培養(yǎng)物中埃博霉素

18、的8個基因區(qū)段表達量均上調(diào)，提升倍數(shù)為2.41-7.16。可能是因為基因簇上存在不止一個啟動子，或者mRNA的不同區(qū)段降解速率不同，導(dǎo)致了各區(qū)段檢測到的表達量提升有所不同。當(dāng)然，影響埃博霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平改變的深層機制還有待闡明。
　　本工作確認(rèn)了粘細菌在淡水沉積物中的普遍存在，表明淡水沉積物是粘細菌的重要生境;詳細探討了粘細菌在各類環(huán)境中的分布及多樣性，發(fā)現(xiàn)土壤粘細菌數(shù)量比例有隨季節(jié)動態(tài)變化的趨勢;粘細菌內(nèi)部各分類單元的季節(jié)性變