致病微生物新型檢測方法及預(yù)防體系應(yīng)用研究.pdf

1、目的:致病微生物作為醫(yī)學(xué)診斷以及食品衛(wèi)生檢測領(lǐng)域最為重要的檢測指標(biāo)之一，一直被全世界微生物專家所關(guān)注。尋找一種快速、簡便的微生物檢測技術(shù)以及設(shè)計一種適用于整個食品生產(chǎn)過程的預(yù)警體系成為控制致病微生物感染和食品污染的重要手段之一。蛋白質(zhì)和核酸是微生物體中最重要的兩類生物分子，依靠抗體或者痕量核酸，借助不同熒光激發(fā)染料或傳感技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今世界致病微生物檢測方法研究的探索前沿。本研究皆在依據(jù)其最新技術(shù)，開發(fā)一系列新型致病微生物快速檢測方法以

2、及預(yù)防應(yīng)用體系，以降低最終致病微生物的感染和對食品的污染。
　　方法:(1)借助納米金顆粒對于熒光染料具有的淬滅特性，依靠核酸適配體對于目標(biāo)特異分子高特異性的親和能力，通過溶血性鏈球菌單鏈DNA核酸適體，既可以與菌體蛋白特異結(jié)合又能與互補寡聚核苷酸形成雙鏈的特點，引入實際樣品到反應(yīng)體系后熒光信號由淬滅變?yōu)榧ぐl(fā)，通過判斷熒光信號強度來實現(xiàn)對溶血性鏈球菌的檢測。(2)借助缺失DNA位點的獨特分子信標(biāo)和互補核苷酸序列設(shè)計，巧妙利用DNA

3、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和互補核苷酸序列雜交互補金黃色葡萄球菌特異DNA序列的特點，通過核苷酸結(jié)構(gòu)構(gòu)相改變，迫使ATMND(2-氨基-5，6，7-三甲基-1，8-萘啶)染料離開缺失位點被重新激發(fā)熒光，通過檢測熒光信號強度來判斷金黃色葡萄球菌的存在。(3)通過自主免疫大腸埃希氏菌O157∶H7菌體抗原、建立雜交瘤細(xì)胞株，依靠血清凝集實驗以及酶聯(lián)免疫抗體鑒定效價等手段，自主免疫并獲得大腸埃希氏菌O157∶H7單克隆抗體。(4)研發(fā)一種基于抗原抗體特異性的酶

4、聯(lián)免疫反應(yīng)快速檢測大腸埃希氏菌O157∶H7的電化學(xué)生物免疫傳感方法。方法采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)體系，結(jié)合堿性磷酸酶等催化銀單質(zhì)特性，依托玻璃作為芯片基底的微間隙插指電極陣列傳感器件，根據(jù)生物傳感器電化學(xué)相關(guān)信號強度的變化，實現(xiàn)對大腸埃希氏菌O157∶ H7的分析。(5)依靠食品加工企業(yè)微生物危害分析與關(guān)鍵控制點原理，對容易造成微生物污染的醬肉類企業(yè)進(jìn)行風(fēng)險干預(yù)，再通過微生物危害性控制點進(jìn)行評估，找出加工過程微生物污染關(guān)鍵控制點環(huán)節(jié)，

5、建立相關(guān)微生物污染預(yù)防體系，運用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法以及自主開發(fā)無標(biāo)記染料分子信標(biāo)探針技術(shù)等檢測手段，綜合降低微生物污染的可能。
　　結(jié)果:(1)借助核酸適配體對于溶血性鏈球菌高特異性的親和能力，其方法檢測該菌線性范圍為4.9102-4.9107CFU/mL，最低檢出限理論值為33 CFU/mL。(2)依靠無標(biāo)記染料結(jié)合基因缺失位點設(shè)計分子信標(biāo)序列探針與互補核苷酸序列探針，當(dāng)金黃色葡萄球菌的特異性序列出現(xiàn)后，其熒光強度數(shù)值迅速增強，而

6、沒有金黃色葡萄球菌的目標(biāo)序列存在時熒光強度變化不明顯。熒光強度的變化可以直接反應(yīng)出細(xì)菌的存在與否。(3)通過對大腸埃希氏菌O157∶H7菌體抗原進(jìn)行小鼠免疫，得到效價穩(wěn)定、質(zhì)量可靠的大腸埃希氏菌O157∶H7單克隆抗體，其免疫小鼠后腹水效價達(dá)到1∶104。(4)微陣列間隙插指電極表面在堿性磷酸酶的催化作用下，出現(xiàn)沉積的單質(zhì)銀顆粒，從而改變導(dǎo)電性狀，結(jié)果顯示當(dāng)大腸埃希氏菌O157∶H7濃度為1103CFU/mL、1105CFU/mL、11

7、08CFU/mL時線性關(guān)系良好，同時，本方法對于其他對照革蘭陽性和革蘭陰性菌具有明顯的非特異性。該器件完全可達(dá)到國家相關(guān)準(zhǔn)則對于微生物“檢出或未檢出”的檢測要求。(5)微生物預(yù)防與控制體系在該企業(yè)進(jìn)行初步應(yīng)用后，微生物出廠檢驗合格率的差異具有顯著性意義，且金黃色葡萄球菌檢出時間由72小時縮短到24-48小時左右。
　　結(jié)論:借助核酸和蛋白質(zhì)的痕量分析檢測方法在臨床診斷、衛(wèi)生檢驗與食品監(jiān)督領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用前景。由于基因探針系列方法

8、判斷致病微生物的存在是通過熒光分光光度計進(jìn)行分析，同時，該實驗方法所需的試劑價廉且易獲得，核酸適體序列也易合成，對人員操作技能的要求也不高，故檢測體系通用性很強，本實驗原理適用于不同種類的微生物檢測。同時，操作簡單、反應(yīng)迅速、特異性高、靈敏度強、試劑攜帶方便、檢測方法具有廣闊的應(yīng)用前景和市場需求。本研究中所開發(fā)的玻璃基底微陣列間隙插指電極芯片較傳統(tǒng)硅材料芯片價格低廉，對實驗操作技能的要求也不高，完全可以在不久的將來取代現(xiàn)有包括臨床檢驗以