全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、全程自養(yǎng)脫氮，即Deammonification，是一種新型的污水脫氮工藝。它是指在同一反應器中，在限氧和較高pH值條件下，完全由自養(yǎng)菌群作用將氨氮轉(zhuǎn)化為氮氣而除去的現(xiàn)象。它于90年代后期被發(fā)現(xiàn)，主要存在于生物轉(zhuǎn)盤、生物濾池和生物流化床等生物膜系統(tǒng)中。近幾年來，國外的許多研究機構(gòu)開始了對全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的研究。本研究也是污水脫氮領(lǐng)域的前沿課題之一。 本論文建立了全程自養(yǎng)脫氮的完全混合活性污泥反應器和懸浮填

2、料反應器2個系統(tǒng)，以市政污水處理廠二沉池活性污泥進行接種，通過3個月至半年的馴化，并精確控制反應條件，在實驗室成功富集了具有較高全程自養(yǎng)脫氮效率的污泥微生物樣本。這是首次對連續(xù)運行的活性污泥反應器中的全程自養(yǎng)脫氮現(xiàn)象進行研究。 在此基礎(chǔ)上，本論文綜合使用多種分子生物學手段，主要是16SrRNA同源性分析方法、分子克隆文庫構(gòu)建和熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，分析全程自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)中的微生物群落組成，對參與全程自養(yǎng)脫氮的關(guān)鍵細菌進行系

3、統(tǒng)發(fā)育分析，觀察全混污泥和懸浮填料2個反應器在不同操作條件和不同處理效果時的菌群動態(tài)變化，揭示系統(tǒng)中微生物群落的空間結(jié)構(gòu)和相互作用關(guān)系，探索以分子手段對反應器運行進行動態(tài)實時監(jiān)測的可行性，全面闡述全程自養(yǎng)脫氮反應的微生物學機制，并基于雙層膜結(jié)構(gòu)理論，提出了關(guān)于全混合活性污泥模式不可持續(xù)的原因的假說。 本論文建立的全混合活性污泥反應器，從馴化開始大約80天后，總氮去除率可達62﹪，系統(tǒng)的容積去除率達到85mgN/(Ld)，然而，在

4、大約100天后，系統(tǒng)的脫氮效率明顯下降，直至最終脫氮效果幾乎全面喪失。批式試驗證明：80天時的污泥生物相可以在限制溶氧條件下，將NH4+-N氧化成NO2--N，同時又可催化NH4+-N和NO2--N反應生成N2，整個脫氮過程不需外加有機碳源，符合全程自養(yǎng)脫氮的全部條件。而懸浮填料反應器在經(jīng)過4-5周的試運行完成掛膜后，總氮去除率為70﹪±5﹪，容積去除效率為95±12mgN/(Ld)，在近300天的實驗期內(nèi)，該反應器均保持相當好的脫氮效

5、果。 為了摸索出最有效的DNA提取方法，本文分別采用酶法、化學法、珠磨勻漿法和反復凍融法對活性污泥樣品進行破壁，提取總DNA，并通過提取的核酸總量、純度、片段分布情況、是否含有PCR反應酶抑制劑、以及ITS擴增產(chǎn)物多態(tài)性共5個指標來評價不同的細胞破壁方法對活性污泥總DNA提取效果的影響。結(jié)果表明：化學法的優(yōu)勢最明顯，結(jié)果最穩(wěn)定。提取的總量最多，片段長度也大，但是雜質(zhì)含量也較大，純度較低，不過這些雜質(zhì)并不影響PCR反應。ITS擴增

6、產(chǎn)物長度多態(tài)性分析也證明化學法的偏倚性最小。因此，本文在以后的研究中采用化學法提取總DNA。 本文在全混污泥反應器和懸浮填料反應器運行的不同階段取樣，使用真細菌通用引物926f和1545r對污泥總DNA進行PCR擴增，克隆文庫的分析結(jié)果顯示：在活性污泥系統(tǒng)逐步惡化的過程中，其中的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了巨大變化，類浮霉狀菌屬細菌Planctomycetes從占據(jù)優(yōu)勢到完全消失，而氨氧化菌克隆從只占文庫的2.4﹪上升到占70﹪。這一過程還

7、伴隨著大量異養(yǎng)細菌的消亡。在懸浮填料系統(tǒng)中，類Planctomycete細菌、Nitrosomonas屬氨氧化菌、和另外一些功能未知的、能在貧營養(yǎng)條件下生存的紫細菌構(gòu)成了其中穩(wěn)定的生物相。這一結(jié)果表明：類浮霉狀菌屬Planctomycete細菌是全程自養(yǎng)脫氮過程的關(guān)鍵種群，它的消失是反應器脫氮效率降低的直接原因。類Planctomycete細菌和Nitrosomonas屬氨氧化菌是全程自養(yǎng)脫氮生物相中最重要的2個成員。本實驗室的全混污泥

8、反應器和懸浮填料反應器中的類Planctomycete菌克隆彼此親緣關(guān)系較近，但與已知的Anammox細菌CandidatusBrocadiaanammoxidans和CandidatusKueneniaStuttgartiensis的親緣關(guān)系較遠。這說明：能夠完成自養(yǎng)脫氮的浮霉狀菌在種的水平上可能是很豐富的。本文還發(fā)現(xiàn)反應器運行不同階段的氨氧化菌都屬于Nitrosomonas屬，但其中的優(yōu)勢種并不相同。 為了了解不同目標基因?qū)?/p>

9、氨氧化菌種群分析結(jié)果的影響，理解多種手段的重復交叉驗證對于科學實驗的重要意義，本文針對3類目標基因，16SrDNA上的氨氧化菌特異的CTO片段、氨單加氧酶活性基因amoA片段和16S-23SrRNA基因間隔序列ITS片段，建立克隆文庫或通過電泳分離，考察不同污泥樣品中的氨氧化菌組成和種群內(nèi)變遷。結(jié)果表明：隨著馴化的進行，Nitrosospira屬細菌和Nitrosomonasoligotropha細菌逐漸被能夠耐受高氨氮低溶氧的Nitr

10、osomonaseuropaea細菌所代替。而氨氧化菌的種群變遷可能并不是全混流系統(tǒng)全程自養(yǎng)脫氮效率下降的原因。在方法學方面，本文發(fā)現(xiàn)：基于CTO片段和氨單加氧酶活性基因amoA片段的研究結(jié)果吻合良好。 FISH試驗表明：在全程自養(yǎng)脫氮反應器中，存在一種在可見光下呈紅色的菌落。這一菌落能夠與類Planctomycete細菌的16SrRNA探針雜交。在活性污泥系統(tǒng)中，雜交區(qū)域位于一個大菌落中心，被大量異養(yǎng)細菌緊密包圍。氨氧化菌探針

11、的雜交實驗顯示：氨氧化菌點綴于菌群中，沒有聚集生長的趨勢。這一結(jié)果充分肯定了在全混污泥系統(tǒng)中，異養(yǎng)細菌的作用——維持共生體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為關(guān)鍵細菌類Planctomycete創(chuàng)造良好的生長代謝環(huán)境——無氧的自養(yǎng)的微生境。而生物膜系統(tǒng)能夠較長時間的穩(wěn)定運行，是由于有微生物共生體所需要支持性載體存在。 本文還以全程自養(yǎng)脫氮類浮霉狀菌的特征序列、ITS擴增片段長度多態(tài)性和隨機引物擴增多態(tài)性為分子標記，進行了反應器分子監(jiān)測的試驗?？疾焓?/p>

12、政污水處理廠活性污泥、全程自養(yǎng)脫氮反應器污泥中的優(yōu)勢菌群演變情況，以及污泥生物多樣性變化情況。以類浮霉狀菌的特征序列為基礎(chǔ)設(shè)計的引物在市政污水處理廠污泥和反應器污泥中都擴增出目標條帶。擴增產(chǎn)物的克隆文庫表明：這對引物能夠擴增出2種類浮霉狀細菌，其中一種經(jīng)馴化篩選后，成為反應器中的優(yōu)勢菌群。這意味著全程自養(yǎng)脫氮反應很可能是浮霉狀菌屬中的一些菌種在特定條件下形成的一種特殊的代謝途經(jīng)。 本文進行了以ITS擴增多態(tài)性和隨機引物擴增多態(tài)性