應(yīng)用模型細(xì)胞膜探究二氧化硅納米顆粒對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和相態(tài)的影響.pdf

1、納米二氧化硅是使用量最多的納米材料之一，具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，在制藥、醫(yī)療、生物科技等方面具有廣泛應(yīng)用，這增加了生物體與其接觸的機(jī)會(huì)。有研究報(bào)導(dǎo)塵肺病等疾病的產(chǎn)生與長(zhǎng)期接觸二氧化硅納米顆粒(SiO2 NP)有關(guān)，但是其致病機(jī)理仍不明確。SiO2 NP與細(xì)胞膜的直接接觸是導(dǎo)致細(xì)胞毒性的重要途徑。因此，本論文對(duì)SiO2 NP與細(xì)胞膜的相互作用進(jìn)行了深入研究。
　　細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和相態(tài)的流動(dòng)性是細(xì)胞進(jìn)行正常生命活動(dòng)的必要條件，本論文

2、基于細(xì)胞膜這兩個(gè)與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)探究了納米顆粒對(duì)細(xì)胞膜完整性和相態(tài)流動(dòng)性的影響。由于細(xì)胞的代謝活動(dòng)會(huì)干擾對(duì)納米顆粒與細(xì)胞膜界面作用的認(rèn)識(shí)，本論文采用人工生物膜——大單層囊泡(GUV)和小單層囊泡(SUV)作為細(xì)胞膜模型，研究不同分散狀態(tài)以及表面修飾的SiO2 NP對(duì)細(xì)胞膜的影響。此外，本論文還從RBL-2H3細(xì)胞中提取了質(zhì)膜囊泡(GPMV)作為介于真實(shí)細(xì)胞膜和人工生物膜之間的細(xì)胞膜模型，從分子水平討論了納米顆粒改變細(xì)胞膜相態(tài)的機(jī)理，

3、進(jìn)一步完善了關(guān)于納米顆粒與細(xì)胞膜界面作用的認(rèn)識(shí)，為納米材料的安全使用提供重要信息。
　　1.SiO2等納米氧化物對(duì)模擬細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性的影響
　　本研究比較了SiO2 NP及其它四種常用的納米氧化物Al2O3、Fe2O3、TiO2、ZnO與模擬細(xì)胞膜的界面作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在靜電作用下Al2O3和SiO2 NP破壞了帶有相反電性的細(xì)胞膜完整性。然而Fe2O3、TiO2和ZnO NP并沒(méi)有對(duì)細(xì)胞膜造成明顯的破壞。將相態(tài)指示

4、探針Laurdan加入模擬細(xì)胞膜中，其熒光光譜表明SiO2 NP能夠使細(xì)胞膜向膠態(tài)化轉(zhuǎn)變。而Al2O3和ZnO NP僅使電性相反的細(xì)胞膜向膠態(tài)化轉(zhuǎn)變。通過(guò)傅里葉紅外光譜技術(shù)(FT-IR)探究納米顆粒對(duì)磷脂分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明Al2O3和SiO2 NP會(huì)結(jié)合磷脂分子的羰基或者磷酸基團(tuán)形成氫鍵。其中，SiO2 NP與細(xì)胞膜之間的氫鍵作用更強(qiáng)。因此，氫鍵作用使Al2O3和SiO2 NP破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變了細(xì)胞膜的相態(tài)。
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5、.不同分散狀態(tài)和表面修飾的SiO2 NP對(duì)磷脂層的影響
　　由于SiO2 NP對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷更為嚴(yán)重，選取不同分散狀態(tài)及表面修飾的SiO2 NP，深入探討了SiO2 NP對(duì)模擬細(xì)胞膜GUV結(jié)構(gòu)和相態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn)靜電吸引促進(jìn)顆粒與磷脂分子之間形成氫鍵，幾種不同的SiO2 NP均對(duì)相反電性GUV的形態(tài)破壞更嚴(yán)重，但對(duì)電性相同的GUV破壞作用較弱。增加SiO2 NP的暴露時(shí)間和劑量加劇了膜損傷。此外，由于納米顆粒易沉積增大了顆粒

6、物與GUV的接觸機(jī)率，快速沉降的SiO2 NP粉末對(duì)GUV破壞程度要強(qiáng)于穩(wěn)定分散的SiO2 NP膠體。相態(tài)指示探針Laurdan的熒光光譜表明負(fù)電的SiO2 NP引起細(xì)胞膜的膠態(tài)化;而經(jīng)過(guò)表面修飾帶正電的SiO2 NP對(duì)正電性和電中性的GUV的相態(tài)影響不明顯，但是能夠使電負(fù)性的GUV向膠態(tài)移動(dòng)。
　　3.SiO2 NP吸附腐殖酸和蛋白質(zhì)后對(duì)細(xì)胞膜的影響
　　SiO2 NP排放進(jìn)入環(huán)境后會(huì)帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)。SiO2 NP在自然界中

7、容易吸附腐殖酸(HA)等天然有機(jī)物，在人體體液中則容易吸附蛋白質(zhì)等生物分子，這會(huì)改變顆粒的表面性質(zhì)和生物毒性，從而影響SiO2 NP與細(xì)胞膜之間的相互的作用。因此牛血清蛋白(BSA)和腐殖酸被用來(lái)處理SiO2 NP(BSA-SiO2 NP和HA-SiO2NP)，探究吸附BSA或HA后的SiO2 NP對(duì)模擬細(xì)胞膜完整性和相態(tài)的影響。顯微觀察表明，與裸顆粒相比BSA-和HA-SiO2 NP對(duì)GUV的破壞作用較慢，而B(niǎo)SA-SiO2 NP對(duì)G

8、UV的破壞作用最弱。這是因?yàn)锽SA和HA覆蓋了SiO2 NP表面的Si-OH以及SiO-，從而減弱了SiO2 NP與磷脂分子之間的相互作用。石英晶體微天平測(cè)定表明BSA-SiO2 NP吸附在未破裂的SUV表面，而HA-SiO2 NP和裸顆粒則迅速引起SUV破裂。吸附BSA和HA后的SiO2 NP對(duì)細(xì)胞膜相態(tài)的改變不同于裸顆粒，其中HA-SiO2 NP使細(xì)胞膜膠態(tài)化最顯著，而B(niǎo)SA-SiO2 NP對(duì)細(xì)胞膜的相態(tài)影響最弱。因此，蛋白質(zhì)能夠有

9、效地減弱SiO2 NP對(duì)細(xì)胞膜完整性和相態(tài)的影響。
　　4.SiO2 NP對(duì)質(zhì)膜囊泡相態(tài)的影響
　　由于人工生物膜的組成成分與真實(shí)細(xì)胞膜存在差異，本論文從RBL-2H3細(xì)胞中提取質(zhì)膜囊泡作為介于真實(shí)細(xì)胞膜和人工生物膜之間的細(xì)胞膜模型，并研究細(xì)胞膜分子組成在SiO2 NP改變細(xì)胞膜相態(tài)過(guò)程中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，用甲基-β-環(huán)糊精去除膜內(nèi)膽固醇的GPMV與SiO2 NP接觸后，膜相態(tài)向膠態(tài)移動(dòng)更顯著。實(shí)驗(yàn)使用PFA/DTT和NEM

10、兩種起泡劑刺激細(xì)胞起泡制備磷脂組成不同的GPMV。其中PFA/DTT起泡劑會(huì)減少細(xì)胞膜中的腦磷脂(PE)和磷酸肌醇(PI)的含量，NEM起泡劑制備的GPMV磷脂組分接近原細(xì)胞膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去除PE和PI的GPMV暴露在SiO2 NP中其相態(tài)向膠態(tài)化轉(zhuǎn)變更顯著。此外，溫度升高時(shí)GPMV受SiO2 NP影響后膠態(tài)化更嚴(yán)重。
　　由于細(xì)胞生命活動(dòng)需要隔離的胞內(nèi)空間和流動(dòng)態(tài)的細(xì)胞膜來(lái)支持膜蛋白并控制物質(zhì)進(jìn)出，對(duì)細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性的破