刺槐無(wú)性系轉(zhuǎn)化體系的建立及液泡型na39;h39;逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文刺槐無(wú)性系轉(zhuǎn)化體系的建立及液泡型Na/H逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆姓名：劉欣玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：森林培育指導(dǎo)教師：曹幫華20060609山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要刺槐( R o b i n i a p s e u d o a c a c i a ) 是一種多用途豆科固氮樹(shù)種( 觀(guān)賞、木材、飼料、蜜源樹(shù)種) ，它生長(zhǎng)快，材質(zhì)好，因此已成為人工造林的首選樹(shù)種。但其有限的耐鹽能力卻限制著其栽種范圍，利用基因工程

2、手段對(duì)其耐鹽性進(jìn)行改造是一條重鹽堿地區(qū)發(fā)展刺槐林的重要途徑。N a + 在液泡內(nèi)區(qū)隔化的關(guān)鍵因子液泡膜N 謝逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是植物耐鹽基因工程的關(guān)鍵因子，本工作在建立刺槐優(yōu)良無(wú)性系高效再生體系的基礎(chǔ)上，利用天然的植物轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)一根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，在3 5 S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，將來(lái)自于苜蓿的抗鹽基因M s N t t X I 導(dǎo)入刺槐離體葉片。同時(shí)對(duì)刺槐液泡膜N a + ／一逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行了克隆并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析。試驗(yàn)選用的刺槐無(wú)

3、性系為8 4 0 5 3 ，利用其嫩莖、葉片和刺槐種子萌發(fā)后獲得的子葉、下胚軸和幼胚作為外植體，分別研究愈傷組織形成與芽再生能力。嫩莖為外植體時(shí)，3 3 ．3 ％外植體產(chǎn)生了不定芽，每個(gè)外植體產(chǎn)生不定芽個(gè)數(shù)為2 ．3 個(gè)；子葉培養(yǎng)中，4 0 ％的外植體形成愈傷組織，形成愈傷組織的速度慢，而且只有5 0 ％愈傷分化出1 - 2 個(gè)芽；下胚軸培養(yǎng)中，7d就可以在下胚軸的兩端產(chǎn)生大量愈傷并出現(xiàn)芽分化，平均1 個(gè)外植體分化5個(gè)芽，有的可達(dá)7 ．

4、8 個(gè)芽；葉片培養(yǎng)中采用兩步法，平均每塊分化愈傷塊產(chǎn)生的有效嫩梢( 大于1 ．0c m ) 數(shù)量可達(dá)1 2 個(gè)，該再生體系能夠滿(mǎn)足基因轉(zhuǎn)化的需要，可以用于該刺槐無(wú)性系的遺傳轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)對(duì)T D Z ( T h i d i a z u r o n )在刺槐離體葉片再生芽誘導(dǎo)中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在附加2m g ／L T D Z 與0 ．1m g ／L N A A 的培養(yǎng)基上芽再生效率最高，平均每塊外植體產(chǎn)生1 5 個(gè)不定芽，且T D

5、Z 濃度越高，產(chǎn)生不定芽的數(shù)量越多。但是隨著T D Z含量的增加，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)多的愈傷組織，使再生芽不能正常伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，試管苗玻璃化，并抑制芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。通過(guò)將再生芽轉(zhuǎn)移到含有少量T D Z0 ．0 5m g ，L ，同時(shí)添加B A O ．5 m g I L 、N A A O ．0 1 m g 幾的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，較好的解決了這一問(wèn)題。根據(jù)分化根的數(shù)量和長(zhǎng)度確定添加O ．5 m g ／LI B A 的培養(yǎng)基可以最好地誘導(dǎo)剌槐試管苗根的