提高重組e.coli產(chǎn)膽固醇氧化酶水平的研究

1、江南大學(xué)碩士學(xué)位論文提高重組E.coli產(chǎn)膽固醇氧化酶水平的研究姓名：王長城申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：楊海麟20090601A b s t m e tA b s t r a c tT h e s i g n i f i c a n tf u n c t i o n so fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ( E C1 ．1 ．3 ．6 ，C O D ) i nf o o dp r o

2、 c e s s i n g ，m e d i c a l a s s a y a n d b i o l o g i c a l p e s t —r e s i s t a n c e w e r e r e c o g n i z e d g r a d u a l l y a n d s h o w e dp o t e n t i a l l yu s e ．n l i sr e s e a r c hi sm a i n l

3、 yf o c u s e do no p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o no f r e c o m b i n a n tE c o l it oi m p r o v et h e l e v e l o f e n z y m e p r o d u c t i o n ．T h ep r o d u c f i o n o fc h o l e s t e r o l o x i d

4、 a s ew a ss t u d i e d u s i n gr e c o m b i n a n tE c o l i J M l0 9 ．o p t i m i z e d t h ef e r m e n t a t i o n m e d i u m ， i n d u c i n g c o n d i t i o n s a n de n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n

5、 s ．O p t i m i z a t i o no f c u l t u r e m e d i u m i sg l y c e r o l1 0 9 ／L ，t r y p t o n e1 0 e g L ，Y e a s t p o w e r 5 e d L ，a n d t h eb e s t i n d u c t i o n t i m e i s i n t e r m e d i a t e c e l l

6、 d e n s i t y ．o p t i m i z a t i o no fI P T Gc o n c e n t r a t i o ni s0 ．3 m m o l ／La n dt h ei n d u c i n g t i m e i s 6 h ．T h ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s i s i n c o l a t i o n s i z e5 ％(

7、 V N ) ，i n t i a lp H 7 ．5 c u l t u r e d a t3 7 ℃o nr o t a r y s h a k e ra t 1 8 0 r ／m i na n dt h e s u i t a b l ev o l u m eo f m e d i u m w a s10 0m L i n 5 0 0 m L f l a s k ．U n d e r t h eo p t i m i z e dc

8、 u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s ．t h e e n z y m e a c t i v i t y r e a c h e d16 8 6 ．5 7 U ／L ．w h i c h i S2 ．4t i m e s o f 7 0 0 U ／L b e f o r e o p t i m i z a t i o n ．T h r o u g h r e s e a r c ho n d

9、i f f e r e n t s u b s t r a t e s ’f e d ．b a t c h ． r e c o m b i n a n t E c o l i ’Sh i g h d e n s i t yc u l t u r eW a sr e a l i z e ．I ti sf o u n d t h a tt h o u g hp H - s t a t m e t h o dc a l lg e t r e

10、l a t i v e l l yh i g hd r yc e l lw e i g h t4 2 ．6 8 e g L ( D C W ) ，i t sf e r m e n t a t i o nc y c l ei s l o n g ( 3 6 h ) ，w h i c hi s n o tb e n e f i c i a l f o rp r o d u c t i o n i n t e n s i t y ’Si m

11、p r o v e m e n t ．E x p o n e n t i a l f e e d i n gs t r a t e g yt h a tt h es p e c i f i cg r o w t h r a t ew a sc o n t r o l l e da t d i f f e r e n tt i m e sh a sr e a l i z e ds h o r tt e r mh i g hd e n s

12、i t y c u l t u r e ，w i t hD C Wr e a c h i n g4 0 ．1 3 9 ／La t l4 t h h o u r ．I t ’S a l s o f o u n dt h a ti n d u c i n gr e c o m b i n a n tE c o l it o e x p r e s sC h o l e s t e r o lo x i d a s ea ti n t e r

13、 m e d i a t ec e l l d e n s i t yi sg o o d ．A n d t h eh i g h e s t c h o l e s t e r o lo x i d a s ea c t i v i t y ( 6 4 3 6 。3 5U ／L 。w h i c hi s 9 。2 t i m e so f 7 0 0U | L b e f o r eo p t i m i z a t i o n )

14、 a n dh i g h e s tc h o l e s t e r o lo x i d a s e p r o d u c t i v i t y ( 4 5 9 ．7 5U ／( L ·h ) ) w e r ea c h i e v e d ．T h r o u g ht h ee x p e r i m e n tt h a t c h e a pa n d i n n o x i o u sl a c t o

15、s ei n s t e a do fd e a ra n dn o x i o u sI P T Gi n d u c er e c o m b i n a n tE c o l i t o e x p r e s sC O D ．I tw a sf o u n d t h a t 1 a c t o s ec o u l di n d u c ef o r e i g n p r o t e i ne x p r e s s i o

16、 na n de n h a n c ec e l l g r o w t h d u r i n gt h e i n d u c t i o np e r i o d ．I t ’Sa l s of o u n dt h a t d u r i n gt h ei n d u c e ro f a d d i n gl a c t o s e ，E ．c o l i h a sa b o u t10 h ’S a d a p t i

17、 o np e r i o dt ol a c t o s e ．T h r o u g h r e s e a r c ho n c o m p o u n d i n t e r f l o w 謝t l lc a r b o n s u b s t r a t e ( g l y c e r i n ea n d l a c t o s e )t o i n d u c er e c o m b i n a n tE c o l

18、i t o e x p r e s sC O D ．i tW a s f o u n dt h i sm e t h o dd i d n ’te l i m i n a t eE c o l ii a d a p t i o np e r i o d t o1 a c t o s e ．w h i l e p H ．s t a t m e t h o d ’Sf e d ．b a t c ho v e r c o m e dn e g

19、 a t i v ee f f e c t d u e t o l o n g t e r m ’s s t a r v a t i o n o f a d a p t i o n p e r i o d ．I t s e n z y m ep r o d u c t i o n r e a c h e d6 0 0 5 ．6 6 U ／L ．9 3 ．3 ％o f I P T G ’S i n d u c i n g 1 e v e

20、l ；c h o l e s t e r o l o x i d a s e p r o d u c t i v i t y 2 0 0 ．1 9U ／( L ．h ) ，4 7 ．4 ％o f I P T G ’S i n d u c i n g l e v e l ．K e y w a r d s ：c h o l e s t e r o l o x i d a s e ，r e c o m b i n a n t E ．c o l