ns5b蛋白以不同hcv基因型負(fù)鏈339;末端rna為模板時(shí)的復(fù)制活性分析

1、南華大學(xué)碩士學(xué)位論文NS5B蛋白以不同HCV基因型負(fù)鏈3'末端RNA為模板時(shí)的復(fù)制活性分析姓名：胡果宇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：@指導(dǎo)教師：甘潤(rùn)良;陳緒林200701012NS5B 蛋白以不同 蛋白以不同 HCV 基因型負(fù)鏈 基因型負(fù)鏈 3’末端 末端 RNA 為模板時(shí)的復(fù)制活性分析 為模板時(shí)的復(fù)制活性分析 碩 士 生：胡 果 宇 導(dǎo) 師：甘 潤(rùn) 良 教 授 陳 緒 林 研究員 碩 士 生：胡 果 宇 導(dǎo) 師：甘

2、 潤(rùn) 良 教 授 陳 緒 林 研究員 中 文 摘 要 中 文 摘 要 目的： 目的：通過(guò)體外的 RNA 依賴的 RNA 聚合（RdRp）反應(yīng)，分別比較 HCV 1a 和 1b 型來(lái)源的NS5B 蛋白以不同 HCV 基因型負(fù)鏈 3’末端 RNA 為模板時(shí)的復(fù)制活性，為優(yōu)化以 NS5B 為靶點(diǎn)的抗 HCV 藥物篩選模型提供理論依據(jù)。 方法： 方法： 構(gòu)建原核表達(dá) HCV 1b 型 NS5B 蛋白

3、的重組表達(dá)質(zhì)粒 pETHis5B2， 將已構(gòu)建好的原核表達(dá) HCV 1a 型 NS5B 蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒 pETHis5B1 和 pETHis5B2 以同樣的條件轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，也以同樣的條件進(jìn)行表達(dá)和純化，Western blot 鑒定表達(dá)的蛋白。構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒 pGEM1a(-)3’T、pGEM1b(-)3’T、pGEM2a(-)3’T，體外轉(zhuǎn)錄出 HCV 1a、1b 和2a 型負(fù)鏈 3’末端 RNA， 純化后用

4、于體外 RdRp 反應(yīng)。 以 1a 型負(fù)鏈 3’末端 RNA 為模板， NS5B1和 NS5B2 為聚合酶，進(jìn)行體外的 RNA 合成反應(yīng)，斑點(diǎn)雜交和 RT-PCR 檢測(cè)產(chǎn)物，確定純化的蛋白具有 RdRp 活性。分別以體外轉(zhuǎn)錄的 HCV 1a、1b 和 2a 型負(fù)鏈 3’末端 RNA 作為模板RNA，NS5B1 和 NS5B2 為聚合酶進(jìn)行體外 RdRp 反應(yīng)，Northern blot 檢測(cè)產(chǎn)物合成情況。 結(jié)果： 結(jié)果： 原核表達(dá)并純化

5、了可溶性的 HCV 1a 和 1b 型 NS5B 蛋白， 純化效果較好。 純化的 NS5B蛋白具有體外 RdRp 活性， 能夠以 HCV 負(fù)鏈 3’末端 RNA 為模板體外合成一條與模板大小相近的產(chǎn)物。兩種 NS5B 蛋白對(duì) HCV 1a、1b 和 2a 型負(fù)鏈 3’末端 RNA 模板表現(xiàn)出相同的活性差異，兩種蛋白均對(duì) 2a 型負(fù)鏈 3’末端 RNA 模板表現(xiàn)出最高的聚合酶活性，對(duì) 1b 型負(fù)鏈 3’末端 RNA 模板表現(xiàn)出最低的酶活性