太湖溶藻芽孢桿菌的溶藻作用及機(jī)制研究.pdf

1、針對(duì)我國(guó)湖泊面臨的嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化及其災(zāi)害問(wèn)題，探索浮游藻類(lèi)生物量的控制、抑制“水華”發(fā)生、改善湖泊水質(zhì)的有效途徑是非常必要的。溶藻細(xì)菌作為水生生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分對(duì)維持藻類(lèi)生物量平衡具有重要的作用，一些國(guó)外研究者認(rèn)為水華的突然消亡就可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)。溶藻細(xì)菌作為水華防治的微生物已引起越來(lái)越多的關(guān)注。 本課題前期在太湖現(xiàn)場(chǎng)放置的除藻中試裝置中，以維綸(聚乙烯醇纖維)作為人工介質(zhì)，采用自然富集的方法進(jìn)行掛

2、膜，富集溶藻細(xì)菌，對(duì)太湖水體進(jìn)行除藻研究，取得了較為滿意的除藻效果。并在已掛膜并經(jīng)一段時(shí)期運(yùn)行的維綸介質(zhì)上成功分離篩選出1株溶藻細(xì)菌，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。對(duì)其進(jìn)行溶藻機(jī)制的初步探討，發(fā)現(xiàn)它主要是通過(guò)胞外分泌物作用于藻細(xì)胞而溶藻的。此外，前期研究中還初步建立了針對(duì)溶藻假單胞菌屬的PCR定性、定量檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用于太湖流域現(xiàn)場(chǎng)的溶藻細(xì)菌監(jiān)測(cè)。 在此基礎(chǔ)上，本課題旨在從太湖除藻中試裝置中分離篩選溶藻效果較顯著的新的溶藻細(xì)菌，對(duì)其溶藻

3、能力進(jìn)行評(píng)價(jià)；在細(xì)菌溶藻機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，分離純化和鑒定出高效且避免二次污染的細(xì)菌溶藻物質(zhì)，對(duì)該活性物質(zhì)的溶藻能力及生物安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。同時(shí)對(duì)溶藻細(xì)菌進(jìn)行固定化研究，篩選固化效果最佳的溶藻細(xì)菌．人工介質(zhì)復(fù)合體并對(duì)其溶藻能力進(jìn)行評(píng)價(jià)；進(jìn)一步完善環(huán)境溶藻細(xì)菌的RTQ-PCR定量檢測(cè)技術(shù)，為該技術(shù)應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)化水體治理提供科學(xué)依據(jù)。 1．太湖溶藻芽孢桿菌的分離與評(píng)價(jià)以維綸(聚乙烯醇纖維)作為人工介質(zhì)，在太湖現(xiàn)場(chǎng)采用自然富集的方法

4、進(jìn)行掛膜，富集溶藻細(xì)菌。從經(jīng)一段時(shí)間運(yùn)行并取得較滿意除藻效果的維綸介質(zhì)上分離篩選溶藻效果較顯著的細(xì)菌，經(jīng)生理、生化檢測(cè)及16S rRNA熒光圖譜鑒定為芽孢桿菌屬。對(duì)其溶藻效果進(jìn)行評(píng)價(jià)：在4.5×10<'7>個(gè)/ml的銅綠微囊藻液中，不同濃度的溶藻芽孢桿菌均顯示有溶藻作用，作用的強(qiáng)弱與細(xì)菌濃度相關(guān)。lO<'3>-10<'7>個(gè)/ml菌液的24h溶藻率分別為11﹪、33﹪、53﹪、71﹪、基金資助：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)資助項(xiàng)目(

5、2002AA601011)江蘇省自然科學(xué)基金(BK2005068)教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20050286035)92﹪。溶藻芽孢桿菌的溶藻作用強(qiáng)弱與藻細(xì)胞濃度也呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，該細(xì)菌作用10<'5>-10<'9>個(gè)/ml藻液24h后藻細(xì)胞去除率分別為98﹪、88﹪、59﹪、41﹪、22﹪。藻毒素降解試驗(yàn)：在作用第18、36、54、72h后，細(xì)菌對(duì)總藻毒素降解率分別為15﹪、29﹪、73﹪、100﹪。對(duì)其溶藻機(jī)制進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)其菌液

6、胞外濾液有溶藻作用。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)溶藻細(xì)菌在維綸介質(zhì)上的細(xì)菌豐度，監(jiān)測(cè)不同時(shí)間空間太湖中試除藻裝置中人工介質(zhì)對(duì)溶藻細(xì)菌的富集效果。7、8、9三個(gè)月假單胞菌屬、芽孢桿菌屬在環(huán)境樣本中的豐度均呈遞增趨勢(shì)，10月假單胞菌屬、芽孢桿菌屬在環(huán)境樣本中的豐度與9月相比無(wú)明顯變化，豐度基本保持在一個(gè)水平。11月、12月假單胞菌屬在環(huán)境樣本中的豐度急劇下降，芽孢桿菌屬豐度有所下降但幅度不大。 2.溶藻芽孢桿菌活性物質(zhì)的分離、鑒定及

7、評(píng)價(jià)應(yīng)用化學(xué)分離提取方法從溶藻細(xì)菌的胞外代謝產(chǎn)物中分離篩選出溶藻物質(zhì)，經(jīng)<'1>Ht-NMR，<'13>C-NMR，紅外，高分辨質(zhì)譜確證該溶藻物質(zhì)分子式為C<,6>H<,15>N<,4>O<,2>。分子量為175.1204。該物質(zhì)對(duì)10<'7>個(gè)/ml微囊藻細(xì)胞的48小時(shí)溶藻EC<,50>為0.373 mg/ml。95﹪可信區(qū)間為0.350mg/ml-0.397mg/ml。中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明該物質(zhì)在0.4mg/ml-0.1

8、mg/ml劑量范圍無(wú)細(xì)胞毒性。對(duì)芽孢桿菌胞外濾液的溶藻活性進(jìn)行定量分析，并與芽孢桿菌菌液的溶藻效果進(jìn)行比較：對(duì)10<'7>個(gè)/ml微囊藻細(xì)胞作用48小時(shí)后10ml、30ml、60ml、90ml去菌體濾液的藻細(xì)胞去除率分別為29﹪、44﹪、70﹪、96﹪，90ml去菌體濾液的溶藻效果與10ml相同菌體濃度發(fā)酵液的溶藻效果相當(dāng)。對(duì)分離提取過(guò)程的各級(jí)中間提取物進(jìn)行活性追蹤，對(duì)10<'7>個(gè)/mI微囊藻細(xì)胞作用48小時(shí)后去菌體濾液、濃縮濾液、萃

9、取水層、甲醇溶解液固體殘?jiān)脑寮?xì)胞去除率分別為100﹪、91﹪、84﹪、80﹪。表明在分離提取過(guò)程中溶藻活性有所損失。對(duì)分離提取過(guò)程中間提取物進(jìn)行急性溶藻試驗(yàn)，確定各中間提取物的48小時(shí)溶藻EC<,50>：芽孢桿菌發(fā)酵液的48小時(shí)溶藻EC<,50>為10<'3>個(gè)/ml，芽孢桿菌胞外濃縮濾液的48小時(shí)溶藻EC<,50>為2.94× 10<'-2>ml/ml，芽孢桿菌胞外氯仿萃取水層的48小時(shí)溶藻EC<,50>為5.47×10<'-2>m

10、l/ml，芽孢桿菌胞外甲醇溶解液固體殘?jiān)?8小時(shí)溶藻EC<,50>為20.5 mg/ml。 3.溶藻芽孢桿菌的固定化與評(píng)價(jià)對(duì)MTT比色法應(yīng)用于檢測(cè)活菌數(shù)的可行性及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探討，確定MTT法可以應(yīng)用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，但有一定的適用范圍。應(yīng)用海藻酸鈉和聚乙烯醇包埋法固定溶藻細(xì)菌，對(duì)兩種固化細(xì)菌的固化效果及溶藻效果進(jìn)行評(píng)價(jià)：PVA-SA固化小球的機(jī)械強(qiáng)度比海藻酸鈉固化小球好；海藻酸鈉固化小球的傳質(zhì)能力比PVA-SA固化小球好。BG

11、ll藻培養(yǎng)液中海藻酸鈉固化芽孢桿菌、PVA-SA固化芽孢桿菌、游離芽孢桿菌的48小時(shí)溶藻率為98﹪、79﹪、93﹪：加入細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的BGll藻培養(yǎng)液中海藻酸鈉固化芽孢桿菌、PVA-SA固化芽孢桿菌、游離芽孢桿菌的48小時(shí)溶藻率為100﹪、93﹪、94﹪。應(yīng)用聚乙烯醇(PVA)纖維(太湖現(xiàn)場(chǎng)已運(yùn)行一段時(shí)間并取得較滿意除藻效果的介質(zhì))、聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維膜、聚乳酸(PLLA)納米纖維膜(本課題組運(yùn)用新型電紡技術(shù)新近合成的納米纖維)