趨化實(shí)驗(yàn)

1、IL-8生物活性的測(cè)定,基本原理：IL-8是典型的CXC家族趨化因子，對(duì)嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞有趨化作用。IL-8的趨化作用沒(méi)有種屬特異性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒細(xì)胞代替人嗜中性粒細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行活性檢測(cè)。,趨化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞移動(dòng)方式有兩類：化學(xué)增活現(xiàn)象，指增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)這種活性的比較簡(jiǎn)易，快速，重復(fù)性好的方法。趨化性，指誘導(dǎo)細(xì)胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向移動(dòng)。瓊脂糖中的趨化

2、實(shí)驗(yàn)和微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)則是常用的測(cè)定細(xì)胞因子趨化活性的方法。,微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)：微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)是根據(jù)靶細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等）能夠趨化性主動(dòng)遷移，穿過(guò)一定孔徑的濾膜而設(shè)計(jì)的。濾膜將小室分隔成上下兩部分。靶細(xì)胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過(guò)濾膜形成梯度，細(xì)胞則沿著梯度穿過(guò)膜孔，黏附在膜的下面，計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測(cè)出趨化因子的趨化能力。,,,趨化材料和趨化時(shí)間的選擇：

3、趨化濾膜的材料和孔徑需根據(jù)靶細(xì)胞的大小選擇；中性粒細(xì)胞用3μm孔徑的PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes）, 趨化時(shí)間為30分鐘；單核細(xì)胞用8µm孔徑的PVPF聚碳酸膜，趨化時(shí)間為90分鐘；粘附力弱的淋巴細(xì)胞則用表面復(fù)以明膠或纖粘素的5µm或8µmPVPF聚碳酸膜，以免淋巴細(xì)胞穿過(guò)膜后落入下室，趨化時(shí)間為180分鐘。,不同趨化因子濃度的確定：趨化因子特異活

4、性非常高，某些趨化因子在較高濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞趨化的作用反而降低，所以待測(cè)樣品常需連續(xù)5倍或10倍系列稀釋以獲得最適劑量的趨化結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)都需設(shè)好對(duì)照，因?yàn)椴煌瑏?lái)源或活力靶細(xì)胞的趨化能力差異很大,趨化因子活性的表達(dá)方式有三種，其中最常用的是用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)（chemotactic index,CI）是指細(xì)胞遷移到待測(cè)樣品液的數(shù)目和遷移到對(duì)照液的數(shù)目的比值。,試劑和材料：純化的IL-8

5、 注射器，離心管，移液器，Tip頭 0.17% D(+)-糖原/生理鹽水 解剖器械（剪刀，鑷子，止血鉗）PBS, 紅細(xì)胞裂解液 趨化小室，趨化濾膜，細(xì)胞刮子Serum-free RPMI1640 計(jì)數(shù)板，玻璃片，顯微鏡，甲醇，Gimsa染色液 紅細(xì)胞裂解液： 豚鼠中

6、性粒細(xì)胞， 0.17M Tris/0.16MNH4Cl液體石蠟， 將10ml0.17MTris加到90ml 0.16M NH4Cl中，調(diào)PH7.2,,實(shí)驗(yàn)程序：一豚鼠嗜中性粒

7、細(xì)胞的制備：1）取成年豚鼠1只，腹腔注射含0.17%糖原的生理鹽水，13小時(shí)后，用PBS緩沖液沖洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min 10min,棄上清。2）輕輕彈起沉淀，用3-5ml PH 7.2的37℃預(yù)溫的（ Tris-NH4CL） 紅細(xì)胞溶解液，充分吹散，作用3-5分鐘，立即加入10-15ml serum-free RPMI1640,吹打均勻，1500rpm/min 5min,棄上清，再加入serum-free R

8、PMI1640,離洗兩次。得到豚鼠嗜中性粒細(xì)胞，純度可達(dá)97%以上。3）將純化后的嗜中性粒細(xì)胞溶在serum-free RPMI 1640中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5x105/ml，備用。,二．樣品的準(zhǔn)備：將純化的IL-8用PBS分別稀釋為1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,0.1ng/ml。同時(shí)用稀釋IL-8的PBS作陰性對(duì)照。（樣品加入小室前最好放入37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫， 以免

9、加樣時(shí)出氣泡）。,2 3 4 5 6 7IL-8(1µg) PBS PBS PBS PBS PBS PBS 180µl 180µl

10、 180µl 180µl 180µl 100µl 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl(棄去20µl),,倍比稀釋(1:10),,,,,,倍比稀釋(1:2)真核上清

11、 PBS PBS PBS200µl 100µl 100µl 100µl100µl 100µl 100µl 100µl（棄去100µl）（載體對(duì)

12、照稀釋同上）,,,,,三．準(zhǔn)備底層小室，加樣：1）將趨化小室底層板放水平臺(tái)上，NP標(biāo)記位于右下方。2）將稀釋好后預(yù)溫的樣品加入孔中，使液面微微隆起，每孔27µl， （國(guó)產(chǎn)板每孔25µl），每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔。為防止樣品過(guò)度蒸發(fā)，整個(gè)加樣過(guò)程應(yīng)不超過(guò)5分鐘。3）將適當(dāng)孔徑的濾膜取出，在濾膜的一角剪去1mm的小角，缺角對(duì) 著NP標(biāo)記，分別用鑷子夾住濾膜兩端，水平下降，中間部位最先接觸小室液面，將膜平放

13、在加完樣的底層板上。4）鋪上硅膠墊，裝上上層板，硅膠墊的缺角及上層板的NP標(biāo)記位于右下方。裝上螺絲，擰緊裝置。,四．加入細(xì)胞：1）將已稀釋好的細(xì)胞懸液加入上層小孔中，每孔50µl，加樣時(shí)微量加樣器Tip頭貼著小孔壁，Tip頭末端恰好位于濾膜稍上方，垂直快速加樣，避免孔底滯留氣泡，（注意這一步加樣過(guò)程中一定不要有氣泡形成）。2）檢查上層液體中是否有氣泡，一個(gè)比較簡(jiǎn)便的方法是觀察小孔凸的反射光，如果小孔上方

14、有一個(gè)異常大的凸液面，通常表明有滯留氣泡。解決的辦法是用Tip頭將孔中的液體吸干凈，重新加樣。,五．孵育：將趨化小室放入37℃ 5%CO2孵箱中，孵育30分鐘。,六．取出濾膜，清洗，染色： 1) 取出濾膜，擰下螺帽，將整個(gè)小室倒置，托著上層板的四角， 將小室慢慢地水平放在紙巾上，卸下下層板。 2) 清洗，遷移細(xì)胞現(xiàn)位于濾膜朝上的一面，此面稱為細(xì)胞面，另一面為 非細(xì)胞面，用鑷子夾起濾膜的一角，然后用大

15、塑料夾夾住濾膜這一端距邊緣1mm的寬度，拎起濾膜，迅速用塑料夾夾住濾膜另一端。在盛有PBS緩沖液的平皿中沾濕非細(xì)胞面，注意細(xì)胞面不要接觸到PBS。 3) 在細(xì)胞刮上刮去非細(xì)胞面上的細(xì)胞，靠近大夾子處的濾膜先接 觸細(xì)胞刮，在與細(xì)胞刮成30度角方向輕輕上拉，該過(guò)程重復(fù)兩 次。 4) 固定，小心將濾膜浸入甲醇中，室溫3分鐘，將濾膜取出，用塑 料夾夾住，自然干燥。5) 染色，將固定后的濾膜在Gimsa染色液中染

16、色30分鐘，自來(lái)水沖洗，置于玻片上，顯微鏡下觀察。 6) 計(jì)數(shù)，在高倍鏡下，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，累積細(xì)胞數(shù)，算出三個(gè)復(fù)孔的平均值。作為該稀釋度的遷移細(xì)胞數(shù)。,IL-8組趨化的細(xì)胞數(shù)與緩沖液對(duì)照組中趨化細(xì)胞 數(shù)的比值即為趨化指數(shù)，趨化指數(shù)大于2有意 義。,技術(shù)要點(diǎn)： 1）.分離純化嗜中性粒細(xì)胞時(shí)，要仔細(xì)認(rèn)真保證細(xì)胞活力。 2）.每次做實(shí)驗(yàn)均要設(shè)陰性對(duì)照，用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清做趨 化實(shí)驗(yàn)時(shí)，要設(shè)空載體

17、轉(zhuǎn)染上清做陰性對(duì)照。 3）.向趨化小室下孔中加樣品時(shí)，上樣量要適中，使之能形 成稍微隆起的液面，既能防止氣泡形成，又可以防止樣 品發(fā)生交叉污染 4）.每個(gè)樣品要做三個(gè)復(fù)孔。 5）.放膜時(shí)要對(duì)準(zhǔn)位置，過(guò)多調(diào)整位置，易發(fā)生交叉污染。 6）.洗膜時(shí)注意，不要把細(xì)胞面與非細(xì)胞面弄反。 7）.不同趨化因子的趨化譜不同，用不同細(xì)胞做趨化反時(shí)， 應(yīng)選用不同孔徑的濾膜、不同的細(xì)胞濃度和不同的趨