玉米秸稈為原料燃料乙醇制備的關鍵問題研究.pdf

1、木質纖維素是地球上最豐富、最廉價的可再生資源，被認為是最重要的乙醇生產的后續(xù)資源物質。但在以木質纖維素為原料進行乙醇制備方面仍存在原料預處理技術難、纖維素酶水解成本高和木糖尚無法被利用產酒精等問題，纖維素乙醇的價格尚無法與糧食乙醇競爭，解決纖維素乙醇制備過程中的關鍵技術已成為全世界共識。本論文針對目前制約木質纖維素物質生產乙醇的主要技術瓶頸，在原料預處理、纖維素降解菌群在纖維素酒精生產中的應用和木糖利用方面進行以下研究：
　　根據(jù)

2、微波加熱的基本原理，結合預處理的目標和特點，將微波引入秸稈的預處理過程，對不同的吸波介質進行了比較和選擇，確定水是對纖維素酶毒性最小、預處理效果較好且環(huán)保經濟的吸波介質。優(yōu)化出微波預處理玉米秸稈的工藝參數(shù)為液固比為58:1，微波功率為630 W，處理時間為5.5分鐘，在該條件下，微波預處理玉米秸稈的酶解率可達到49.12％。應用原子力顯微鏡(AFM)觀察微波水預處理前后的秸稈表面形貌，結合本研究中預處理前后秸稈成分的變化結果，發(fā)現(xiàn)微波預

3、處理是利用水分子在秸稈表面“鉆孔”從而增大秸稈與纖維素酶的接觸面積，也使得纖維素酶容易進入秸稈內部進行水解從而達到提高酶解效率的目的。
　　從自然環(huán)境中分離篩選出高效產酶且酶活穩(wěn)定的纖維素降解菌株 FLZ6和FLZ10，采用形態(tài)學、生理生化和微生物細胞膜脂肪酸特異性分析，鑒定FLZ6為地衣芽孢桿菌(Bacillus-licheniformis)，F(xiàn)LZ10為毛殼菌(Chaetomium spp）。應用FLZ6和FLZ10構建纖維素

4、降解菌群代替纖維素酶使用，進行同時糖化發(fā)酵(SSF)生產乙醇的研究，通過測定反應體系中的乙醇含量，對SSF工藝進行了優(yōu)化，最終確定了 SSF工藝的最佳條件為：反應溫度37℃，初始 pH6.0，纖維素降解菌群和酵母菌的比例為1:1，反應時間36小時。在該條件下，獲得了13.1 g/100 g秸稈的乙醇。
　　從富含豐富的腐爛纖維素的土壤中分離篩選出一株木糖發(fā)酵酵母菌株FL-20-2。采用形態(tài)學、生理生化和分子生物學方法將這株菌鑒定為

5、假絲酵母屬中的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。在確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組份(木糖50 g/L，酵母粉0.5 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4.7H2O0.4 g/L)的基礎上，進行菌株代謝特性分析。發(fā)現(xiàn)FL20-2在以木糖為唯一碳源時，pH5.5，溫度35℃，接種量為10%的厭氧條件下培養(yǎng)96 h，乙醇產量最高，為其利用木糖生成乙醇理論產量的32.4%，此時伴有31.05 g/L的木糖醇生成。在以木糖和葡

6、萄糖的混合糖為碳源時，相同發(fā)酵條件下，木糖和葡萄糖轉化的乙醇產量分別為其理論產量的37.7%和79.2%，同時伴有30.2 g/L的木糖醇產生。采用纖維素降解菌群和熱帶假絲酵母混合，對經過微波預處理的玉米秸稈進行乙醇制備研究，在纖維素降解菌群和熱帶假絲酵母菌按體積比1:1，10％接種量，溫度為40℃，時間84 h條件下，乙醇產量為17.9 g/100g玉米秸稈，同時伴有10.05 g/100 g玉米秸稈的木糖醇生成。
　　通過對假

7、絲酵母菌屬(Candida sp.)木糖還原酶基因序列保守區(qū)域的分析，設計了一系列引物，以近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)的總RNA為模板，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法成功獲取了Candida parapsilosis木糖還原酶基因，其開放閱讀框長度為954 bp，使用Blastn程序進行檢索后發(fā)現(xiàn)與白色假絲酵母(Candida albicans)的醛糖

8、還原酶(aldose reductase，XM715658)同源性最高，相似性為80%，通過進化關系分析認定本文發(fā)現(xiàn)了一種新的木糖還原酶基因，其登錄號為：EF033247。選用巴斯德畢赤酵母表達載體pGAPZαA為載體，將獲得的木糖還原酶基因開放閱讀框克隆該表達載體pGAP啟動子下，構建分泌型重組質粒，該重組質粒同源重組到畢赤酵母基因組上進行穩(wěn)定表達，表達產物采用鎳離子親和層析柱進行純化，得到約36-kDa蛋白條帶。酶學性質的分析表明，

9、重組蛋白具有較高的木糖催化效率(kcat/Km=61/mM/min)和不同于其它木糖還原酶的輔酶特性，其依賴于NADH的催化效率(kcat/Km=41.5/μM/min)大于依賴于NADPH的催化效率(kcat/Km=2.2/μM/min)。
　　本論文通過上述研究，基本確定了以玉米秸稈為原料進行乙醇制備的工藝過程，采用本論文的技術，可獲得17.9 g乙醇/100g玉米秸稈這一較高的乙醇產量；同時通過對木糖利用關鍵酶-木糖還原酶的