用多種方法提取酸性排水沉積物中微生物DNA.pdf

1、通過DNA序列認(rèn)識參與催化酸性排水(AMD)污染形成的微生物的前提條件是尋找到適于樣品的DNA提取方法。江西德興銅礦規(guī)模巨大，開礦歷史久遠(yuǎn)，對周圍大片區(qū)域造成了嚴(yán)重污染。本研究以該礦的三個(gè)不同特征樣品(C，Z和Y:有機(jī)碳含量分別為0.59％，1.40％和3.23％；Z比C和Y含較多沙粒)為例，考察了幾種不同的樣品預(yù)洗滌、提取和純化方法對DNA提取物質(zhì)量的影響，以建立適于該礦區(qū)及類似礦區(qū)的微生物DNA提取方法。質(zhì)量評價(jià)包括提取量，片段大小

2、，純度，16S rDNA基因擴(kuò)增效果，以及ISR(Intergenic Spacer Region)基因多樣性。
　　 樣品預(yù)洗滌采用四種溶液：P(Na2HPO4和NaH2PO4:0.1M)，E(Na2EDTA:0.5M)， TEN2+TX-100(Na2EDTA，Tris-HCl和Na3PO4:0.1M；NaCl:1.5M；TX-100:0.05％)，以及TEN3+TX-100+PVP(Na2EDTA， Tris-HCl， N

3、aCl和Na4P2O7:0.1M；TX-100:0.05％；PVP:1％；只用于Y樣品)。預(yù)洗滌只用于如下提及的前兩種提取方法。
　　 DNA提取采用四種方法：高鹽凍融法(簡稱M1法，提取液為TEN2+TX-100+1％CTAB，-78℃和65℃交替兩次)，低鹽蛋白酶K法(M2法，提取液含0.1 MNaCl，0.01 M Tris-HCl和0.001 M Na2EDTA；0.1 mg/ml蛋白酶K在50℃作用1小時(shí))，高鹽蛋白酶

4、K法(Zhou法，Appl Environ Microbiol62(2):316-322，不含TX-100的M1法提取液，0.08 mg/ml蛋白酶K在37℃作用0.5小時(shí))，以及ZR Soil MicrobeDNA KitTM法(Kit法，ZYMO Research Corp.)。M1和M2法均序列經(jīng)過溶菌酶、SDS(在凍融前或與蛋白酶K同時(shí))、以及玻璃珠撞擊處理，而Zhou法只經(jīng)SDS振蕩處理(蛋白酶K處理后)。
　　 粗D

5、NA(經(jīng)有機(jī)溶劑處理)的純化采用六種凝膠電泳法。前四種方法均采用普通凝膠，但用如下不同的方法從凝膠中回收DNA:有機(jī)溶劑法，30％ PEG溶液槽法，低熔點(diǎn)凝膠槽法，以及含2％PVP的低熔點(diǎn)凝膠槽法(該法中的普通凝膠也含2％PVP)。后兩種方法在采用低熔點(diǎn)凝膠電泳后不經(jīng)回收(直接用于基因擴(kuò)增)或用試劑盒回收。
　　 研究發(fā)現(xiàn)：雖然M1和M2法均可從有機(jī)碳含量較低的C和Z樣品中提取到DNA，但是M2法需經(jīng)預(yù)洗滌；而從有機(jī)質(zhì)含量較高的

6、Y樣品中，只有經(jīng)預(yù)洗滌才能提取到DNA；Zhou法只能從Z樣品中提取到DNA；Kit法的DNA提取物不能在凝膠上顯現(xiàn)。
　　 研究還發(fā)現(xiàn)：提取到的DNA在經(jīng)普通凝膠電泳和低熔點(diǎn)凝膠槽回收的純化過程后，通?？捎糜?6S rDNA和ISR基因的PCR擴(kuò)增：雖然Kit法的提取物不能在凝膠上顯現(xiàn)，但可成功用于如上兩個(gè)基因(C樣品)和只有16S rDNA基因(Z樣品)的擴(kuò)增。
　　 不同方法所提取到的DNA片段大小相差不大，均在2

7、3.1 kb左右；DNA提取量為1.8μ9/9至14μg/g，但通常小于10μg/g；提取量隨方法而不同，M1法從C樣品中提取到的DNA總是多于M2法，但這兩種方法從Z和Y樣品中的提取量的比較并不顯示一致趨勢，取決于預(yù)洗滌條件；此外，P和TEN2+TX-100預(yù)洗滌的提取量總是高于E預(yù)洗滌。
　　 提取到的DNA純度隨樣品有機(jī)碳含量增高而下降。高鹽預(yù)洗滌液(TEN2+TX-100)和高鹽提取液(TEN2+TX-100+1％CTA

8、B)均可使DNA提取物的純度下降，特別是有機(jī)碳含量高的Y樣品。考慮PCR擴(kuò)增的可行性，純化結(jié)果的穩(wěn)定性，以及試驗(yàn)操作的簡易性，通過普通凝膠電泳及低熔點(diǎn)凝膠槽回收被確定為本實(shí)驗(yàn)樣品的最佳純化方法。
　　 不同提取方法的ISR電泳圖譜顯示出不同的擴(kuò)增帶型(數(shù)量，位置和強(qiáng)度)。對于C樣品，經(jīng)TEN2+TX-100預(yù)洗滌的M2法所得到的帶數(shù)最多。對于Z和Y樣品，差別則主要表現(xiàn)在帶的強(qiáng)度上。
　　 以上結(jié)果表明，為了從AMD沉積物