級(jí)四次分生作業(yè)藍(lán)色考題

1、1《分子生物學(xué)》作業(yè)一第24章第8章1.什么是什么是SNP？試述研究？試述研究SNP的意義。的意義。全稱SingleNucleotidePolymphisms，是指在基因組DNA上單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種.。SNP自身的特性決定了它更適合于對(duì)復(fù)雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識(shí)別等方面的研究：1）、SNP數(shù)量多，分布廣泛。2）、SNP適于快速、規(guī)?；Y查。3）、SNP等位基因頻率的容易

2、估計(jì)。4）、易于基因分型。SNPs的二態(tài)性，也有利于對(duì)其進(jìn)行基因分型。對(duì)SNP的深入研究具有以下幾方面意義：的深入研究具有以下幾方面意義：（1）由于SNP的低突變率、高密度、易于檢測(cè)的特性，使得它在遺傳學(xué)分析中得到廣泛應(yīng)用；（2）SNP具有已知性、可遺傳性、可檢測(cè)性，研究SNP可用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。尋找疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)，發(fā)展疾病預(yù)防策略，（3）研究SNP本身對(duì)機(jī)體的影響，尤其是疾病的易感性，從而個(gè)性化醫(yī)療。通過(guò)對(duì)藥物靶點(diǎn)個(gè)

3、體差異性分析，個(gè)性化藥物、方法治療。（4）法醫(yī)學(xué)研究。法醫(yī)檢驗(yàn)中可以用DNA芯片分析SNP位點(diǎn)，應(yīng)用于親權(quán)鑒定等；(5)器官移植中供體受體配對(duì)分析。對(duì)SNP的研究將有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病特別是對(duì)負(fù)責(zé)疾病如腫瘤、某些遺傳疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等的易感性和疾病的關(guān)聯(lián)基因，此外還在法醫(yī)學(xué)和致病基因的搜尋中發(fā)揮重大作用。2.F開(kāi)放閱讀框架(openreadingframe，F(xiàn))：在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼

4、開(kāi)始，到終止密碼為止的一個(gè)連續(xù)編碼序列。3.調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因指一段有效地DNA片段，他通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯而產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白與操縱基因相互作用，從而對(duì)操縱子的活動(dòng)進(jìn)行控制。4.請(qǐng)介紹目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的基本技術(shù)流程并簡(jiǎn)述其原理。請(qǐng)介紹目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的基本技術(shù)流程并簡(jiǎn)述其原理。蛋白質(zhì)組學(xué)常用的研究方法有雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，基于凝膠的工作流程是目前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程。（1）樣品制備—樣品來(lái)源于細(xì)胞

5、、組織、體液等。也可采用全蛋白或進(jìn)行預(yù)分級(jí)（線粒體、高爾基體、葉綠體、膜蛋白、核蛋白等）以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量及檢測(cè)靈敏度。應(yīng)注意盡可能擴(kuò)大蛋白質(zhì)的溶解度和解聚，以提高分辨率。（2）樣品分離—雙向凝膠電泳（twodimensionalelectrophesis，2DE）：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與分子量差異分離之。第一向：等電聚焦IEF第二向：SDSPAGE。（3）染色方法考馬斯亮藍(lán)染色、銀染（不含戊二醛）、熒光染色（Cy3、Cy5），放

6、射性同位素標(biāo)記等。5.簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的原理。簡(jiǎn)述酵母雙雜交技術(shù)的原理。答：答：很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開(kāi)的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域否則無(wú)法完成激活功能。不同來(lái)源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個(gè)原理，可將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白

7、，并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能發(fā)生相互作用，就會(huì)通過(guò)待測(cè)蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定可以很容易地知道待測(cè)蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。3交情況等。8.舉例說(shuō)明載體應(yīng)具備的基本要素以及雙抗生素篩選和藍(lán)白斑篩選的原理。舉例說(shuō)明載體應(yīng)具備的基本要素以及雙抗生素篩選和藍(lán)白斑篩選的原理。(1)載體應(yīng)具有以下特征載體應(yīng)具有以下特征①能自我復(fù)制并具有較高的拷

8、貝數(shù)，并有適宜的相對(duì)分子量，一般應(yīng)10kb②帶有遺傳篩選標(biāo)記；③有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。（2）雙抗生素篩選原理雙抗生素篩選原理：某些質(zhì)粒載體如pBR322質(zhì)粒中裝有Ampr和Tetr抗性基因，在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素對(duì)照篩選。(3)Bluewhite(3)Bluewhitescreen:screen:藍(lán)白斑篩選。藍(lán)白斑篩選。即β半乳糖苷酶基因失活篩選。其原

9、理是：某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ’基因，該基因含一段編碼β半乳糖苷酶氨基末端145個(gè)氨基酸α－肽的DNA片斷，IPTG可誘導(dǎo)此片斷合成，此片斷能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型β半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)α－互補(bǔ)，形成完整的β－半乳糖苷酶。該酶能催化指使劑底物X－gal形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入lacZ’基因中MCS(多克隆位點(diǎn))，lacα－肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無(wú)β－半乳糖苷酶活性，結(jié)果重組克隆呈白色菌落。9.有哪些常用

10、的探針標(biāo)記物？有哪些常用的探針標(biāo)記物？如何進(jìn)行探針的標(biāo)記？如何進(jìn)行探針的標(biāo)記？放射性同位素標(biāo)記放射性同位素標(biāo)記:常用標(biāo)記探針的同位素用標(biāo)記探針的同位素:32P：β，半衰期短（，半衰期短（14.3d），標(biāo)記核苷三磷酸，靈敏度很高，分辨率不高。，標(biāo)記核苷三磷酸，靈敏度很高，分辨率不高。35S：β，標(biāo)記蛋氨酸或取代核苷酸，標(biāo)記蛋氨酸或取代核苷酸α位磷酸基中的氧，靈敏度高，分辨率較位磷酸基中的氧，靈敏度高，分辨率較高，核酸序列測(cè)定和原位雜交。高

11、，核酸序列測(cè)定和原位雜交。3H：β，半衰期長(zhǎng)（，半衰期長(zhǎng)（4417d），使用較少。，使用較少。125I：γ，分辨率高，操作簡(jiǎn)單，安全防護(hù)要求較高，原位雜交。，分辨率高，操作簡(jiǎn)單，安全防護(hù)要求較高，原位雜交。同位素標(biāo)記方法同位素標(biāo)記方法1.缺口平移法（雙鏈）缺口平移法（雙鏈）2隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法（單鏈）（單鏈）3.DNA探針的末端標(biāo)記探針的末端標(biāo)記4PCR標(biāo)記標(biāo)記DNA探針探針5單向體外轉(zhuǎn)錄制備單向體外轉(zhuǎn)錄制備RNA探針探針?lè)欠派湫詷?biāo)記

12、非放射性標(biāo)記1）.酶標(biāo)記核酸探針酶標(biāo)記核酸探針辣根過(guò)氧化物酶（HRP）易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，便宜，易觀察，應(yīng)用最廣泛。常用標(biāo)記方法是戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鈉法2）生物素（生物素（biotin）標(biāo)記核酸探針）標(biāo)記核酸探針應(yīng)用廣泛，可替代同位素標(biāo)記。用鏈親和素系統(tǒng)檢測(cè)。酶促標(biāo)記法操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴。光敏生物素（photobiotin）標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，價(jià)格適宜。地高辛（地高辛（DIG）：）：標(biāo)記于dUTP上，通過(guò)隨機(jī)引物或缺口平移法引入DNA分子中。可

13、長(zhǎng)期保存，不受組織、細(xì)胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高，檢測(cè)產(chǎn)物反差好，背景染色低。廣泛應(yīng)用于Southern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、菌落雜交尤其是原位雜交。熒光素（熒光素（fluescein）：）：標(biāo)記方法有直接法和間接法。非放射性標(biāo)記方法非放射性標(biāo)記方法1.化學(xué)修飾法：簡(jiǎn)單、成本低、較通用?；瘜W(xué)修飾法：簡(jiǎn)單、成本低、較通用。2.酶促反應(yīng)標(biāo)記法：靈敏度高，過(guò)程較復(fù)雜，成本較高。酶促反應(yīng)標(biāo)記法：靈敏度高，過(guò)程較復(fù)雜，成本較高。10.影響核酸

14、分子雜交的因素有那些？如何進(jìn)行雜交條件的優(yōu)化？影響核酸分子雜交的因素有那些？如何進(jìn)行雜交條件的優(yōu)化？影響核酸分子雜交的因素：影響核酸分子雜交的因素：（1）溫度和時(shí)間：一般認(rèn)為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件，越遠(yuǎn)離此溫度，復(fù)性速度就越慢；復(fù)性時(shí)溫度下降必須是一緩慢過(guò)程，若在超過(guò)Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4℃以下），復(fù)性幾乎是不可能的。（2）DNA濃度：DNA復(fù)性的第一步是兩個(gè)單鏈分子間的相互作用“成核”，“成核”速度與DNA