一株破乳菌破乳有效成分分析及其強(qiáng)化培養(yǎng)條件優(yōu)化.pdf

1、生物破乳劑是多種有效成分共存的復(fù)雜體系。目前對(duì)破乳有效成分缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，難于人工調(diào)控活性物質(zhì)的產(chǎn)量導(dǎo)致破乳能力不穩(wěn)定、效率不高是其無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的根本原因。系統(tǒng)分析生物破乳劑成分可使代謝調(diào)控、改善其破乳性能成為可能；同時(shí)尋找新的手段和方法提高破乳效率也可為生物破乳劑的發(fā)展注入新的活力。以破乳菌的分離、篩選為基礎(chǔ)，摸索破乳菌培養(yǎng)條件，明確環(huán)境因素對(duì)其破乳效能的影響；深入研究生物破乳劑的破乳有效成分，優(yōu)化提取、純化手段，分離出破乳活性

2、物質(zhì)并利用現(xiàn)代化表征技術(shù)加以解析；初步探討破乳菌株混合強(qiáng)化培養(yǎng)對(duì)破乳性能的提升。
　　結(jié)合生物表面活性劑的篩選方法及破乳性能測(cè)試，從大慶原油污染土壤中分離出一株高效破乳菌，經(jīng)16SrDNA鑒定，明確該菌為莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis），編號(hào)XH-1。通過(guò)破乳實(shí)驗(yàn)及生物量的測(cè)定，對(duì)影響破乳菌生長(zhǎng)和菌體發(fā)酵液破乳能力的培養(yǎng)條件進(jìn)行考察，使用MMSM培養(yǎng)基,得出最適于培養(yǎng)液破乳的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH6.5

3、，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)140rpm，培養(yǎng)時(shí)間24h。該菌株培養(yǎng)液表現(xiàn)出優(yōu)良的破乳性能：室溫下，接觸時(shí)間48h，40％投加量可實(shí)現(xiàn)O/W模型乳狀液完全破乳；46℃下，接觸時(shí)間10h，排油率在80%以上；55℃下，接觸時(shí)間10h，排油率為100%。
　　通過(guò)對(duì)破乳活性成分分布及有效成分耐熱性、耐酸堿性的考察，借助紅外光譜、紫外可見(jiàn)光譜等分析手段確定蛋白類物質(zhì)為該生物破乳劑的破乳有效成分之一，同時(shí)蛋白在溶液中的構(gòu)象對(duì)其破乳能力至關(guān)重

4、要。破乳活性物質(zhì)存在于細(xì)胞外，粘連在菌體周圍或游離于發(fā)酵液中，菌體本身不具有破乳能力。采用反復(fù)凍融手段及蛋白變性劑處理后，除菌上清液仍保持至少30%破乳活性，證明非蛋白類組分在破乳過(guò)程中的作用。
　　提取破乳有效成分，通過(guò)對(duì)粗提產(chǎn)物破乳能力、產(chǎn)量的比較，選擇最佳粗提方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：XH-1上清液中提取出的多糖、脂類、脂肽類物質(zhì)基本不具有破乳能力；25%~45%硫酸銨分離及有機(jī)溶劑沉淀法均可有效地將破乳活性物質(zhì)提取出來(lái)。使用乙醇沉淀

5、法進(jìn)行粗提，提取產(chǎn)率高，產(chǎn)物破乳效果好，方法可重復(fù)性強(qiáng)。改進(jìn)提取工藝，粗提產(chǎn)率可達(dá)91%，室溫下48h粗提產(chǎn)物排油率接近100%。通過(guò)對(duì)粗提產(chǎn)物成分及分子量分布分析發(fā)現(xiàn)：粗提物是多種蛋白、多糖等大分子物質(zhì)和分子量低于1000D的小分子產(chǎn)物共存的復(fù)雜體系。
　　選用HiTrap Butyl-S FF疏水相互作用層析，結(jié)合Superdex75凝膠排阻層析的分離方法，純化粗提產(chǎn)物，得到破乳活性物質(zhì)。純化產(chǎn)物溶液經(jīng)液相色譜分離得到單峰，通

6、過(guò)質(zhì)譜鑒定確定為具有PEG結(jié)構(gòu)單元的小分子。這些物質(zhì)分子量分布范圍從200～1000D，在溶液中聚結(jié)為膠團(tuán)，在破乳過(guò)程承擔(dān)重要作用。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）比較破乳能力不同組分間差異。酶切差異條帶后進(jìn)行質(zhì)譜分析，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，得到四種蛋白，其中一種為疏水蛋白。確認(rèn)疏水蛋白為破乳有效成分之一，鑒定為Phosphate-binding protein。
　　將破乳菌XH-1與枯草芽胞桿菌(Bacillus sub

7、tilis)在改進(jìn)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中強(qiáng)化培養(yǎng)可以有效地提高生物破乳劑的破乳效率。強(qiáng)化培養(yǎng)液在室溫下，接觸時(shí)間48h可使O/W型模型乳狀液完全破乳。與單一菌株發(fā)酵全培養(yǎng)液相比，縮短了發(fā)酵時(shí)間（提高6h以上），降低了破乳劑投加量，提升了破乳能力和穩(wěn)定性。乳狀液pH3~7的條件下，強(qiáng)化培養(yǎng)液可維持較高破乳活性。具有良好耐溫性，乳狀液溫度在20～120℃，破乳劑排油率變化率在15%以內(nèi)。強(qiáng)化培養(yǎng)后，生物破乳劑仍主要依靠發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物破