第三章-微生物生態(tài)學(xué)基本研究方法

1、第三章：微生物生態(tài)學(xué)的基本研究方法,2024/3/26,1,參考書,陳聲明，林海萍，張立欽主編，微生物生態(tài)學(xué)導(dǎo)論，高等教育出版社，2007池振明主編，2005，現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)，科學(xué)出版社楊家新主編，2004，微生物生態(tài)學(xué)，化學(xué)工業(yè)出版社宋福強(qiáng)主編，2008，化學(xué)工業(yè)出版社張素琴著：2005， 科學(xué)出版社Molecular Microbial Ecology, A. Mark Osborn & Cindy J. Sm

2、ith, Taylor & Francis Group, 2005,2024/3/26,2,2024/3/26,3,專業(yè)期刊,Microbial EcologyApplied and environmental microbiologyAdvances in microbial ecologyISME JournalApplied Microbiology and BiotechnologyFEMS Microbio

3、logy EcologyFrontiers in MicrobiologyGeomicrobiology Journal Nature Microbiology Review,2024/3/26,4,你們能夠想到什么方法開展微生物生態(tài)學(xué)的研究？,微生物生態(tài)學(xué)？,研究微生物與其周圍生物和非生物環(huán)境之間相互關(guān)系的一門學(xué)科,關(guān)注的內(nèi)容：主要研究微生物的分布、種群組成、數(shù)量和活力等與環(huán)境的關(guān)系，以及微生物之間、微生物與高等有機(jī)體之間的相互

4、關(guān)系。,2024/3/26,5,1、經(jīng)典技術(shù)和方法 直接觀察測定 培養(yǎng)研究2、生理生化方法3、分子生物學(xué)方法4、穩(wěn)定同位素方法,2024/3/26,6,1、經(jīng)典技術(shù)和方法——直接觀察測定利用顯微鏡對(duì)樣品中的微生物直接觀察計(jì)算數(shù)目，測定絲狀微生物長度（普通染色、熒光染色）優(yōu)點(diǎn)：直接觀察天然樣品中微生物的形態(tài)和微生物所處的位置缺點(diǎn)：樣品量少，代表性差,2024/3/26,7,Hep G2 Cells Sta

5、ined Using the LIVE/DEAD® Cell Imaging Kit, showing green-fluorescent live cells and red-fluorescent dead cells.,HeLa cells showing negative staining by ICC/IF using only secondary antibody. The cells were 100%

6、 methanol fixed (5 min) and then incubated in 1%BSA / 10% normal goat serum / 0.3M glycine in 0.1% PBS-Tween for 1h to permeabilise the cells and block non-specific protein-protein interactions. The secondary antibody (r

7、ed) was ab150091 Alexa Fluor® 647 goat anti-rabbit IgG (Fc) used at 2µg/ml for 1h. DAPI was used to stain the cell nuclei (blue) at a concentration of 1.43µM.,2024/3/26,8,2024/3/26,9,Archaea in the picture

8、 in red, sulfate reducing Bacteria in green. Credit: Annelie Pernthaler/UFZ,FISH技術(shù),2024/3/26,10,1、經(jīng)典技術(shù)和方法——培養(yǎng)研究對(duì)采集的樣品進(jìn)行稀釋、培養(yǎng)辨認(rèn)培養(yǎng)物的種類,2024/3/26,11,2024/3/26,12,（1）基內(nèi)菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起；（2）菌落邊緣有輻射的菌絲，稱為輻射狀菌絲；（3）生長后期表面形成緊密的

9、絨毛狀或堅(jiān)實(shí)、干燥、不透明、多皺的表面，上面常有一層色彩鮮艷的干粉；（4）可形成絮狀或顆粒狀的典型菌落，菌落的正反面顏色往往不一致，菌落邊緣培養(yǎng)基的平面有變形現(xiàn)象；（5）有特殊氣味（土霉氣味）等。,2024/3/26,13,2024/3/26,14,2024/3/26,15,細(xì)菌菌落,2024/3/26,16,1、經(jīng)典技術(shù)和方法——培養(yǎng)研究優(yōu)點(diǎn)：能對(duì)活的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，并能區(qū)分真菌、放線菌和細(xì)菌缺點(diǎn)：可培養(yǎng)率很低<1%;

10、單菌落是否由一個(gè)細(xì)菌繁殖而來；絲狀微生物菌落究竟是由孢子而來還是由菌絲而來難以區(qū)分,2024/3/26,17,經(jīng)典的觀察和培養(yǎng)方法能夠在一定程度上告訴我們樣品中微生物的數(shù)量、可培養(yǎng)微生物的數(shù)量及類型。但這些結(jié)果不能告訴我們微生物在樣品中能干什么？,2024/3/26,18,包括用于微生物生物量測定的氯仿熏蒸方法、底物誘導(dǎo)呼吸法和光合微生物色素法等；用于測定土壤C礦化速率和微生物呼吸強(qiáng)度等方法；用于測定土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物活性和酶

11、活性的分析方法；測定微生物能量代謝的分析方法等,2、生理生化方法,2024/3/26,19,代謝活力研究：放射性/穩(wěn)定同位素標(biāo)記記某種代謝物，測定代謝活力C14， C13， H3， N15酶活性測定ATP含量測定：ATP僅存在于活的細(xì)胞中，且在細(xì)胞中的含量基本一致,ATP檢測儀,2024/3/26,20,代謝活力研究葉綠素含量測定：估計(jì)藻類和光合細(xì)菌的生物量和代謝活力土壤呼吸速率測定：間接估計(jì)土壤中的生物量，不適于僅有厭氧呼

12、吸或發(fā)酵的微生物測定,土壤呼吸測定儀,2024/3/26,21,代謝活力研究優(yōu)點(diǎn)：能確定樣品中微生物能做什么；缺點(diǎn)：無法說明樣品究竟是哪些微生物在起作用，樣品存在哪些微生物種類和微生物在自然樣品中的分布情況,2024/3/26,22,Biolog微平板法PLFA圖譜分析,2024/3/26,23,Biolog 微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)是美國Biolog 公司從1989 年開始推出的一套微生物鑒定系統(tǒng)，最早進(jìn)入商品化應(yīng)用的是G-好氧細(xì)

13、菌鑒定數(shù)據(jù)庫(GN) ,其后陸續(xù)推出G+好氧細(xì)菌( GP) 、酵母菌( YT) 、厭氧細(xì)菌(AN) 和絲狀真菌(FF) 鑒定數(shù)據(jù)庫。Biolog 系統(tǒng)6101 版數(shù)據(jù)庫共包括1973 種微生物，其中細(xì)菌234 個(gè)屬，1 226 個(gè)種，與其他鑒定系統(tǒng)相比，其微生物種類的數(shù)據(jù)量較大，適合于環(huán)境、食品、工業(yè)、臨床和動(dòng)植物病原菌的鑒定分析。,BIOLOG微平板法,2024/3/26,24,Biolog 自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對(duì)糖、醇、

14、酸、酯、胺和大分子聚合物等95 種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定。細(xì)菌利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí),會(huì)將四唑類氧化還原染色劑( TV) 從無色還原成紫色，從而在鑒定微平板上形成該菌株特征性的反應(yīng)模式或“指紋圖譜”。通過纖維光學(xué)讀取設(shè)備——讀數(shù)儀來讀取顏色變化,由計(jì)算機(jī)通過概率最大模擬法將該反應(yīng)模式或“指紋圖譜”與數(shù)據(jù)庫相比較，將目標(biāo)菌株與數(shù)據(jù)庫相關(guān)菌株的特征數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，獲得最大限度的匹配,可以在瞬間得到鑒定結(jié)果，確定所分析的菌株的屬名或種名。,20

15、24/3/26,25,BIOLOG ECO微平板含3組相同的碳源，根據(jù)平均顏色變化情況，計(jì)算微生物群落的多樣性指數(shù)、代謝特征的變化等。,2024/3/26,26,2024/3/26,27,四氯唑染料,96孔微孔板,2024/3/26,28,培養(yǎng)時(shí)間 (h),,,淺層含水層沉積物中微生物群落培養(yǎng)過程中AWCD的變化,2024/3/26,29,趙銳等，2010,2024/3/26,30,趙銳等，2010,2024/3/26,31,趙銳等

16、，2010,2024/3/26,32,磷脂類化合物只存在于細(xì)胞膜中，不同微生物其磷脂脂肪酸組成和含量都不相同。一旦生物細(xì)胞死亡，其中的磷脂化合物馬上降解。因此該方法十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。,PLFA圖譜分析,2024/3/26,33,細(xì)胞膜磷脂雙分子層,2024/3/26,34,毛細(xì)管柱,2024/3/26,35,Typical GC-FID signal of extracted PLFAs under (a) landfi

17、ll gas ddition (W+LG) and (b) the control treatment (W, grey colour in the enlargement) in 20 cm soil depth. (1) i14:0, (2) 14:0, (3) i15:0, (4) a15:0, (5) 15:0, (6) i16:0, (7) 16:1o8c, (8) 16:1o7c, (9) 16:1o6c, (10) 16

18、:1o5c, (11) 16:0, (12) 10Me16:0, (13) i17:0, (14) a17:0, (15) 17:1o8c, (16) cy17:0, (17) 17:0, (18) 10Me17:0, (19) 18:2o6,9, (20) 18:1o9c, (21) 18:1o8c, (22) 18:1o7c, (23) 18:0, (24) cy19:0, (IS) internal standard 19:0.,

19、Watzinger et al.,2008,Soil Biology & Biochemistry 40 (2008) 751–762,2024/3/26,36,3、分子生物學(xué),2024/3/26,37,3、分子生物學(xué)方法(G+C)摩爾百分含量核酸探針雜交技術(shù)DNA-DNA雜交DNA序列分析基因芯片宏基因組學(xué)基于PCR的指紋圖譜分析,2024/3/26,38,2024/3/26,39,周繼中 Oklahoma,20

20、24/3/26,40,3、分子生物學(xué)方法基于PCR的指紋圖譜分析DGGE/TGGE單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）技術(shù)RAPD (random amplified polymorphic DNA)技術(shù)限制性片段多態(tài)性（RFLP: restriction fragment length polymorphism）/擴(kuò)增性cDNA限制性酶切片段分析（ARDRA: amplified ribosomal DNA restriction

21、 analysis）末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)核糖體基因間隔序列分析（RISA: ribosomal intergenic spacer analysis）/自動(dòng)核糖體基因間隔序列分析（ARISA）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）高度重復(fù)序列或微衛(wèi)星區(qū)域,2024/3/26,41,2024/3/26,42,穩(wěn)定性同位素探針( stable isotope probing ,簡稱SIP) 要先將標(biāo)記的底物13C(或15

22、N) 添加到系統(tǒng)中,然后再提取微生物群落DNA，用梯度離心法把重的DNA (被13C或15N 標(biāo)記) 和輕的DNA (未被13C 或15N 標(biāo)記) 分開。用群落DNA 分析方法分別對(duì)重DNA 和輕DNA 進(jìn)行分析,可以了解活性和非活性微生物群落,從而知道哪些微生物在起作用。SIP 技術(shù)非常明顯的優(yōu)點(diǎn)是可以明確群落中實(shí)際起作用的微生物,但也有一些缺點(diǎn)。如不易檢測數(shù)量很少但活性很高的微生物的活性;鑒于DNA中要求N 的含量相對(duì)較低，SI

23、P 技術(shù)比較適合研究與碳素轉(zhuǎn)化有關(guān)的活性微生物群落。,4、穩(wěn)定同位素?方法,2024/3/26,43,什么是微生物生態(tài)學(xué)？微生物生態(tài)學(xué)的研究方法有哪些？每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？舉例說明,上節(jié)內(nèi)容回顧 2015.12.1,,2024/3/26,44,2024/3/26,45,基本知識(shí),氨氧化NH3+→NO2- →NO3- 硝化作用 amoA（功能基因）氨氧化細(xì)菌（AOB）, 氨氧化古菌（AOA）,,抑制劑的

24、使用：（1） dicyandiamide (DCD,雙氰胺)， allylthiourea（烯丙基硫脲）， Nitrapyrin（三氯甲基吡啶）【對(duì)AOA和AOB均有抑制性，但對(duì)AOB的抑制作用更強(qiáng)】； （2）karrnamycin；sulfathiazole（磺胺噻唑）抗生素類，AOB； （3）NO-scavenger carboxy-PTIO 【強(qiáng)烈抑制AOA，對(duì)AOB影響不大】,二者的功能基因的序列不同，可以用不同的引物分別

25、擴(kuò)增PNR：potential nitrification rate大多數(shù)AOA屬于自養(yǎng)型，少數(shù)混養(yǎng)型,2024/3/26,46,2024/3/26,47,文章剖析,主要觀點(diǎn)：強(qiáng)酸性土壤中氨氧化古菌比氨氧化細(xì)菌對(duì)氨氧化所起的作用更重要涉及到的微生物生態(tài)學(xué)方法：分子生物學(xué)（PCR, DGGE）穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SIP）生理生化方法,2024/3/26,48,主 要 論 據(jù),Significantly positive cor

26、relations between nitrate concentration and amoA gene abundance of AOA, but not of AOB.13CO2-DNA-stable isotope probing results showed significant assimilation of 13C-labeled carbon source into the amoA gene of AOA, but

27、 not of AOB.Addition of the nitrification inhibitor dicyandiamide (DCD,雙氰胺) completely inhibited the nitrification activity and CO2 fixation by AOA, accompanied by decreasing thaumarchaeal amoA gene abundance.Bacterial

28、 amoA gene abundance decreased in all microcosms irrespective of DCD addition, and mostly showed no correlation with nitrate concentrations.,2024/3/26,49,DCD的加入能強(qiáng)烈抑制土壤中氨氧化作用的進(jìn)行.,,無抑制劑,,添加抑制劑,2024/3/26,50,DCD的加入使得AOA amo

29、A基因豐度減少,AOA amoA拷貝數(shù),無DCD,添加DCD,2024/3/26,51,DCD的加入對(duì)AOB amoA基因的豐度變化影響不大,AOB amoA拷貝數(shù),無DCD,添加DCD,2024/3/26,52,AOA amoA拷貝數(shù),NO3-濃度,2024/3/26,53,AOA amoA基因豐度與NO2-濃度正相關(guān)，而AOB amoA基因與NO3-負(fù)相關(guān),2024/3/26,54,穩(wěn)定同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（AOA對(duì)氨氧化起著重要作用）

30、無DCD，NO3-升高，NH4+穩(wěn)定，AOA amoA豐度相對(duì)不變，而AOB amoA豐度下降。有DCD， NO3-不變，NH4+上升，AOA和AOB amoA豐度下降。,NH4+濃度,2024/3/26,55,12C標(biāo)記,12C標(biāo)記,13C標(biāo)記,13C標(biāo)記,13C標(biāo)記+DCD,2024/3/26,56,Eight arrows marked the bands in heavy fraction around a buoyant d

31、ensity of 1.73 gml-1excised for sequencing active 13CO2-labeled AOA belonged to groups 1.1a-associated and 1.1b.,2024/3/26,57,洞穴微生物生態(tài)學(xué)氨氧化微生物生態(tài)學(xué)濕地微生物生態(tài)學(xué)植物共生微生物生態(tài)學(xué)（要求每人下載1篇英文文獻(xiàn)，并就該文獻(xiàn)的主要論點(diǎn)、論據(jù)、方法和結(jié)論等進(jìn)行解說和釋義），交紙質(zhì)版,課后作業(yè),,