BphC酶的純化、固定化及處理芳香化合物的研究.pdf

1、本論文旨在從聯(lián)苯降解菌Dyella ginsengi soliLA-4中純化一種新型外二醇雙加氧酶BphC，進(jìn)行純酶特性考察；重組酶BphC固定化方法的考察；優(yōu)化以海藻酸鈉為載體固定重組酶BphC的條件。
　　 從菌株LA-4中純化一種新型天然酶BphC，并進(jìn)行純酶特性考察，包括：酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、pH值、溫度、金屬離子及抑制劑對(duì)純酶活性的影響等。研究發(fā)現(xiàn)：該酶是Fe(II)依賴型2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶，分子量約為34

2、4±1kDa；N端氨基酸測(cè)序結(jié)果為Ser-Val-Lys-Asn-Leu-Gly-Tyr-Met-Gly-Phe-Ser-Val-Lys-Asp-Val；從細(xì)胞粗提物到純酶，純化倍數(shù)為13.82，酶活性回收率為8.76％；BphC可氧化2，3-二羥基聯(lián)苯、3-甲基鄰苯二酚、4-甲基鄰苯二酚、鄰苯二酚和4-氯鄰苯二酚，對(duì)應(yīng)的比酶活分別為：95.20、14.37、O.15、3.64和0.53U/mg；BphC對(duì)2，3-二羥基聯(lián)苯親和力最大；

3、底物為2，3-二羥基聯(lián)苯時(shí)，該酶最適pH值為8.0，最適溫度為20℃；3-甲基鄰苯二酚和4-甲基鄰苯二酚做底物時(shí)，該酶最適溫度分別為30和20℃；一些金屬離子和抑制劑(抗壞血酸、SDS和過氧化氫)能夠明顯抑制天然酶BphC的活性。
　　 以活性炭、強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、海藻酸鈉、聚乙烯醇和ZnO溶膠-凝膠基質(zhì)為載體，均可以成功固定重組酶BphC。選擇苯甲酸和苯胺為底物時(shí)，載體固定化效果順序?yàn)椋汉Ｔ逅徕c>ZnO溶膠-凝膠基質(zhì)>聚乙

4、烯醇。投加活性炭為載體固定化酶可以提高苯甲酸和苯胺降解率，但主導(dǎo)作用是活性炭對(duì)底物的吸附作用。投加強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂為載體固定化酶可以提高苯甲酸降解率，但主導(dǎo)作用是樹脂對(duì)苯甲酸的吸附作用，而該固定化酶對(duì)苯胺降解影響很小。
　　 應(yīng)用表面響應(yīng)法優(yōu)化了以海藻酸鈉為載體固定化重組酶BphC的條件，考慮了四個(gè)主要影響因素：海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、加酶體積和固定化時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)：聯(lián)苯降解率與上述四個(gè)影響因素不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，由A