解剖小白鼠實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞原代培養(yǎng)(Cell primary culture),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解細(xì)胞體外培養(yǎng)的原理、基本方 法，了解無(wú)菌操作方法及注意事項(xiàng)。 學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng) 狀況。,實(shí)驗(yàn)原理,用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過(guò)程主要是采用無(wú)菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。,消化培養(yǎng)法,又

2、稱為組織消化分散法：將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。,實(shí)驗(yàn)儀器,超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器,超凈臺(tái),超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。,濾 器,濾器工作原理,CO2培養(yǎng)箱,C

3、O2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃ ，14 h)。③箱內(nèi)無(wú)菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。,倒置顯微鏡,自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀,培 養(yǎng) 板,培養(yǎng)瓶,實(shí)驗(yàn)材料,2月齡的小鼠,實(shí)驗(yàn)試劑,（1） 1640-RPMI培養(yǎng)液（2）  小牛血清（3）&#

4、160; 青、鏈霉素（4） PBS液（5）  5％NaHCO3（6）  75％酒精,實(shí)驗(yàn)步驟,一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作 （1）  清洗與消毒（2）  配制溶液（3）  紫外線消毒（4） 洗手和著裝（5） 進(jìn)入無(wú)菌室,實(shí)驗(yàn)步驟,動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程圖,方法與步驟,（1）動(dòng)物拉椎處死（2）取肝及剪碎：剖開(kāi)腹部，將肝臟取出，放入小培養(yǎng)皿中，用PBS液洗滌1次；將肝剪成1mm大

5、小的塊，再用PBS液洗滌2次，直到液體澄清。,（3）消化及分散組織塊：將上述清洗過(guò)的組織放入試管內(nèi)，加入的0.25％胰蛋白酶液，完全沒(méi)過(guò)組織，置37℃水浴中消化20 ～ 30min，每隔10min搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹埂Ｈ〕鲈嚬?，吸去胰蛋白酶液，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，取上清液至另一試管中。,（4）觀察與計(jì)數(shù)：從細(xì)胞懸液中取出1滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目。

6、看到球型的細(xì)胞，證明消化下來(lái)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)成功。,作業(yè):,1.在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如何防止污染?,無(wú)菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng),1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3、操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣