銅耐性植物內(nèi)生和根際細(xì)菌的生物多樣性及其強(qiáng)化植物富集銅的研究.pdf

1、重金屬污染土壤的植物修復(fù)是一種操作簡(jiǎn)便、環(huán)境友好的新興原位修復(fù)技術(shù)，植物體內(nèi)及根際微生物可通過(guò)多種作用方式影響重金屬污染環(huán)境中植物的生長(zhǎng)和土壤重金屬的形態(tài)及植物對(duì)土壤重金屬的吸收，從而影響植物對(duì)重金屬的修復(fù)效率。研究重金屬超積累或耐性植物內(nèi)生及根際細(xì)菌的生物多樣性及其與植物的相互關(guān)系，不僅有助于對(duì)微生物資源及生物多樣性的深入認(rèn)識(shí)，豐富微生物資源庫(kù)，揭示微生物多樣性與植物富集重金屬的關(guān)系，而且可篩選高效植物促生細(xì)菌，為重金屬污染土壤植物修

2、復(fù)特別是內(nèi)生細(xì)菌強(qiáng)化植物聯(lián)合修復(fù)重金屬銅污染土壤提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。
　　 對(duì)不同銅污染區(qū)采集的海州香薷和鴨跖草根直接提取細(xì)菌總DNA，以799 F和1492 R為引物擴(kuò)增部分16S rDNA片段并構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)，16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析揭示海州香薷根部?jī)?nèi)生細(xì)菌主要包括α-，β-，y-Proteobacteria和Bacteroidetes兩大類(lèi)群。γ-Proteobacteria在海州香薷根部細(xì)菌克隆

3、文庫(kù)中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分別占高、低污染區(qū)根部克隆文庫(kù)的73.9％和79.0％；鴨跖草根部?jī)?nèi)生細(xì)菌主要包括α-,β-，y-Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria三大類(lèi)群。屬于y-Proteobacteria的克隆分別占高、低污染及無(wú)污染鴨跖草根部細(xì)菌克隆文庫(kù)的41.0％、77.1％和89.9％，是本研究中檢測(cè)到的最多的一大類(lèi)序列，在鴨跖草根部克隆文庫(kù)中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。屬于Finnicutes的克隆分別占高

4、、低及無(wú)污染鴨跖草根部細(xì)菌克隆文庫(kù)的4.8％、22.9％和10.1％。屬于Actinobacteria的克隆僅在礦區(qū)高污染鴨跖草根部細(xì)菌克隆文庫(kù)發(fā)現(xiàn)，占文庫(kù)的38.6％。隨著土壤銅污染程度的增加，兩種植物根部γ-Proteobacteria細(xì)菌數(shù)量有遞減的趨勢(shì)，而鴨跖草根部革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（Firmicutes和Actinobacteria）比例逐漸增大。
　　 通過(guò)構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)對(duì)銅礦廢棄地海州香薷和鴨跖草根際土壤

5、細(xì)菌群落及多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明兩種植物根際細(xì)菌群落主要可歸屬于10大細(xì)菌類(lèi)群，其中Proteobacteria在整個(gè)克隆文庫(kù)中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。Nitrospira、Chloroflexi、Actinobacteria是僅在海州香薷根際發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌類(lèi)群，Cyanobacteria是僅在鴨跖草根際發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌類(lèi)群。通過(guò)DGGE對(duì)不同污染區(qū)兩種植物根際細(xì)菌群落的研究，發(fā)現(xiàn)海州香薷根際細(xì)菌主要包括四大類(lèi)群：α-，β-，γ-Proteobacteri

6、a、Bacteroidetes、Chloroflexi及TM7門(mén)。鴨跖草根際細(xì)菌主要包括四大類(lèi)群：Acidobacteria、Bacteroidetes、α-，γ-Proteobacteria、Firmicutes。植物根際細(xì)菌群落多樣性可能與植物種類(lèi)、重金屬濃度、土壤性質(zhì)等有關(guān)。隨著污染程度的減輕，海州香薷根際γ-Proteobacteria細(xì)菌比例逐漸增大；鴨跖草根際細(xì)菌多樣性有增加的趨勢(shì)，F(xiàn)irmicutes所占的比例逐漸下降，而

7、Acidobacteria所占比例逐漸增大，且在低度和無(wú)污染區(qū)逐漸出現(xiàn)了α-，γ-Proteobacteria。
　　 通過(guò)平板分離法，從銅耐性植物海州香薷和鴨跖草體內(nèi)和根際土壤中分離篩選出抗銅64mg.L-1的細(xì)菌62株及能以ACC為唯一氮源生長(zhǎng)的菌株19株。利用細(xì)菌通用引物對(duì)分離篩選的供試菌株16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1500 bp片段，并用限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ和MspI對(duì)擴(kuò)增片段分別進(jìn)行了限制性酶切。根據(jù)酶切聚

8、類(lèi)分析結(jié)果挑選代表性菌株測(cè)序并進(jìn)行16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明銅抗性?xún)?nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌具有較豐富的物種多樣性。分離于海州香薷的銅抗性細(xì)菌以不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬等γ-Proteobacteria占優(yōu)勢(shì)；分離于鴨跖草的銅抗性細(xì)菌以芽孢桿菌為主的Firmicutes占優(yōu)勢(shì)。
　　 通過(guò)菌株生物學(xué)特性、重金屬抗性及碳酸銅溶解試驗(yàn)以及砂培試驗(yàn)初步篩選出對(duì)植物具有促生和增強(qiáng)銅吸收效果的3株菌株并分別鑒定為Burkhol

9、deriasp.GL12，Bacillus megaterium JL35和Sphingomonas sp.YM22，該3株菌株均能產(chǎn)生ACC脫氨酶、精氨酸脫羧酶、IAA和鐵載體，并且能夠耐受多種重金屬；它們能夠活化培養(yǎng)液中的沉淀態(tài)堿式碳酸銅。
　　 盆栽試驗(yàn)表明，內(nèi)生菌株GL12, JL35和YM22均能促進(jìn)銅污染土壤中油菜和玉米的生長(zhǎng)，與對(duì)照相比供試植物地上部和根部干重分別增加11-56％和48-125％。接菌處理使油菜和玉

10、米對(duì)Cu的吸收積累量分別比對(duì)照增加31％-48％和42％-91％。
　　 菌株GL12、JL35、YM22能在油菜和玉米根際和根內(nèi)定殖，菌株JL35能在油菜和玉米葉部定殖。接菌處理的油菜和玉米根際土壤水溶性銅含量分別比對(duì)照增加16％-113％和63-94％，菌株GL12還分別使油菜和玉米根際乙酸銨提取態(tài)銅濃度增加51％和14％。接菌處理可能主要通過(guò)增強(qiáng)玉米根部SOD活性及ASA濃度來(lái)緩解過(guò)多重金屬銅引起的過(guò)氧化傷害。玉米根際及根