基因定位與基因克隆

1、基因定位與基因克隆,中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳教研室 陳爭,,常用基因定位的方法 體細(xì)胞雜交 功能克隆和位置克隆 連鎖分析 家系收集 單倍型分析的用途,本節(jié)重點,基因定位（gene mapping） 用不同方法，將基因定位于一特定染色體的實際位置，并確定基因在染色體上線性排列的順序和距離 基因克隆(gene cloning) 用一定

2、的方法把不同位點上的基因分離出來,基因克隆(gene cloning),? 功能克隆? 位置克隆? 候選克隆 功能候選克隆 位置候選克隆,功能克隆(functional cloning)是先研究相關(guān)基因的功能，再定位克隆該基因位置克隆（positional cloning)是先進(jìn)行基因定位作圖，然后找到來自該定位區(qū)的基因并進(jìn)行克隆,,,,功能,制圖,疾病,基因,,,,,,功能克隆,位置克隆,功能克隆,功能克

3、隆,定位克隆(positional cloning),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ATGGTCTCACTGCAACCG,ATGGTCTCACTGTAACCG,Met,Val,Ser,Leu,Stop,,,,,,,用定位克隆法鑒定的致病基因,用定位克隆法鑒定的致病基因,定位候選克隆,,,,,,,,,,,,,,,,GDB或GenBank,已知的基因或EST,

4、,與疾病關(guān)系,,確定致病基因,,,,,候選克隆(candidate cloning),,GDB或GenBank,已知基因,已定位的疾病,,與該基因關(guān)系,,確定致病基因,,,,,功能候選克隆,候選克隆(candidate cloning),常用基因定位和克隆的方法染色體多態(tài)法比較制圖法測序法體細(xì)胞雜交法原位雜交與熒光原位雜交連鎖分析法染色體畸變法全基因組外顯子測序,體細(xì)胞雜交(somatic cell hybridizat

5、ion)又稱細(xì)胞融合(cell fusion)，是將兩個同種和/或不同種的細(xì)胞融合成一個新細(xì)胞，即雜種細(xì)胞(hybrid cell)。,? 病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合——仙臺病毒? 化學(xué)融合技術(shù)——聚乙二醇(PEG)? 電融合技術(shù)——電穿孔法,體細(xì)胞雜交,體細(xì)胞雜交,體細(xì)胞雜交,,,,,,,,,異雙核細(xì)胞,同雙核細(xì)胞,,,,,,,,,,合核細(xì)胞,雜種細(xì)胞,兩個同種的動物細(xì)胞融合后形成的雜種細(xì)胞，細(xì)胞核一般保留雙核的染色體；不同種動物的細(xì)胞融

6、合后，細(xì)胞核含有雙核的的染色體，但隨著增殖傳代的過程，會出現(xiàn)保留一方染色體，另一方染色體逐漸丟失的現(xiàn)象。,HAT選擇系統(tǒng),1962, 人類HGPRT - 1964, 小鼠TK -,? H：次黃嘌呤(hypoxanthine)? T：胸腺嘧啶(Thymidine) ? A：氨基喋呤(Aminopterin),,HPRT－,TK－,HAT選擇系統(tǒng),,,,,,,,,異雙核細(xì)胞,同雙核細(xì)胞,,,,,TK－,HPRT－,,,,,,,HAT選

7、擇系統(tǒng),,體細(xì)胞雜交,TK: chromosome 17,原位雜交技術(shù),原位雜交：利用同位素標(biāo)記的DNA探針，與玻片上的中期染色體進(jìn)行雜交。是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。,熒光原位雜交(FISH)：用特殊的熒光素標(biāo)記DNA探針，與玻片上的染色體或細(xì)胞組織標(biāo)本進(jìn)行雜交。,,13號染色體,,21號染色體,熒光原位雜交技術(shù),12p部分三體 患者FISH結(jié)果,患者母親FISH結(jié)果,連鎖分析(linkage analysis)：利用被定位的基因

8、與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。,連鎖,交換與重組 減數(shù)分裂時，同源染色體會發(fā)生交換和重組,兩個基因（標(biāo)記）之間距離越遠(yuǎn)，出現(xiàn)交換和重組的機(jī)會越多；距離越近，機(jī)會越少。,重組值(recombination fraction)：是基因定位時兩個基因(遺傳標(biāo)記)間遺傳圖距的量度，即基因(遺傳標(biāo)記)間的遺傳距離。根據(jù)基因的重組值(H) 來計算兩位點之間的遺傳圖距，以厘摩(cent

9、imorgan，cM)表示 兩個遺傳座位間有1%的重組率即為1cM ，1cM約為1000kb,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,多點連鎖定位(multipoint linkage mapping),利用三點交叉法(three point crosses)，可將某一致病基因定位于遺傳標(biāo)記的框架內(nèi)，更精確地進(jìn)行基因定位。其優(yōu)點是有助于克服遺傳標(biāo)記的

10、信息有限性，在不同家系，不同的遺傳標(biāo)記提供有用信息。,多點連鎖定位,853 5 47 95,非重組體(A，B) - X - CA – X – (B，C)B – X – (A，C),ABC/abcABc/abcabC/abcaBC/abcAbc/abcAbC/abcaBc/abc,三個基因的排列次序：A→C→B遺傳距離大約為：A-5.2cM-C-9cM-B,大規(guī)模全基因組掃描和

11、 分型的連鎖分析,連鎖分析與全基因組掃描(genome- wide search) ”策略 有表型(遺傳性狀或疾病) 就可以肯定在基因組中有它的基因 有基因則在基因組中必有其位置(位點) 該位點與基因組中的另一位點(如多態(tài)性的遺傳標(biāo)志) 之間必有某種聯(lián)系,連鎖分析的基本原理： ①基因在染色體上呈直線排列，同一染色體上的基因和/或遺傳標(biāo)記形成連鎖 ②位于同一條染色體上的兩個位點在減數(shù)分裂過程

12、中會發(fā)生交換與重組 ③兩個位點之間相距越遠(yuǎn),則發(fā) 生重組的機(jī)率就越高,它們一起 傳給后代的機(jī)會就越小,遺傳圖譜上基因或遺傳標(biāo)記位點之間的距離稱為圖距(map distance), 通常用摩爾(M ) 或厘摩爾(cM ) 表示, 它們之間的關(guān)系為1 摩爾等于100厘摩爾。連鎖分析是根據(jù)家系中親代與后代不同基因位點間的基因型估計出它們之間的重組率, 然后利用定位函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換成以M或cM為單位的圖距,DNA 遺傳多態(tài)性標(biāo)志

13、RFLP ：分布不均勻 ，信息量低VNTR：信息量高，用Southern印跡分析STR：信息量高，6-10Kb一個，可用多重PCR分析SNP：信息量低，但分布廣，平均1Kb一個，可用自動化分析，現(xiàn)已有1；5；10；50萬密度全基因組掃描芯片,當(dāng)發(fā)現(xiàn)家系中疾病位點與某個遺傳標(biāo)志之間毫無連鎖(重組率= 50%) 的證據(jù)時, 則可將其從該遺傳標(biāo)志附近“排除”; 如果發(fā)現(xiàn)它與某個遺傳標(biāo)志之間有一定程度的連鎖(0< 重組率<

14、50%) , 則知道疾病位點已在該遺傳標(biāo)志附近; 如果它與某個遺傳標(biāo)志之間沒有重組(重組率= 0) , 而個體數(shù)(即減數(shù)分裂事件) 又達(dá)到統(tǒng)計學(xué)要求, 這時便可知道該遺傳標(biāo)志已經(jīng)非?？拷膊∥稽c,一、家系的收集與處理用于連鎖分析的理想家系: ①診斷準(zhǔn)確, 且為遷移較小、相對封閉的人群②家系的數(shù)目及大小需達(dá)到一定要求③有明確的遺傳相關(guān)數(shù)據(jù), 如遺傳方式、遺傳度、外顯率等,疾病家系的選擇與評估: ①疾病家系越大越好。據(jù)一般的經(jīng)驗公

15、式,一個有40 多個能提供信息減數(shù)分裂事件的三代以上的家系，基本上可得到“肯定連鎖”的證據(jù) ②不管是大家系還是小家系,對每一個體的診斷是至關(guān)重要的 ③注意發(fā)病的時間性、治療效應(yīng)和發(fā)病年齡 、發(fā)病史,,家系材料的收集與保存：①組織樣本：包括血液及血液濾紙片、活檢組織及切片、分離的細(xì)胞株、毛發(fā)、唾液濾紙片等，可在-70℃或液氮中保存②DNA標(biāo)本：收集到的血液樣本應(yīng)按嚴(yán)格的方法進(jìn)行DNA 抽提和純化，-20～ -70℃中保存③

16、臨床資料：臨床癥狀、發(fā)病情況、家族史④臨床檢驗結(jié)果和家系圖,家系分析應(yīng)注意點：①臨床資料完整準(zhǔn)確②注意外顯不全和遲發(fā)顯性現(xiàn)象③遺傳異質(zhì)性④基因多效性⑤非孟德爾遺傳現(xiàn)象⑥X染色體失活現(xiàn)象,STR 的選擇與制備 選擇STR 一般應(yīng)達(dá)到在染色體上平均覆蓋5 ～ 10 cM 左右。隨后合成擴(kuò)增這些STR 的PCR引物, 并分別于其中的每一條引物5’ 端引入幾種不同的熒光染料(如6- FAM、HEX、TET )進(jìn)行標(biāo)記。目前商

17、品化的ABI PRISM TM Linkage Mapping Set(PE公司出品) 共包含400 個STR , 分辨率< 10 cM , 覆蓋人類整個基因組，而且雜合度高,PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)于96 孔板中進(jìn)行(現(xiàn)多采用在同一反應(yīng)管中進(jìn)行多重PCR 反應(yīng), 使PCR 擴(kuò)增過程更加迅速和方便, 而且 PCR 反應(yīng)液的制備可由與其它設(shè)備配套的機(jī)器手完成取樣和加樣等過程),反應(yīng)終止后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)95 ℃熱變性后即可

18、用于電泳檢測,電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的檢測過程是在自動激發(fā)熒光DNA 測序儀上進(jìn)行的。當(dāng)產(chǎn)物在測序膠中進(jìn)行電泳時, 測序儀上的特殊激光探頭可激發(fā)熒光, 并掃描每一泳道的PCR產(chǎn)物分子量大小。同時, 與測序儀聯(lián)接的計算機(jī)可直觀地將每一產(chǎn)物的產(chǎn)量及分子量大小用曲線峰譜表示出來, 再用相應(yīng)的軟件系統(tǒng)將電泳檢測到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,自動基因分型 主要是應(yīng)用GENSCAN 和Genotyper 軟件完成 分型步驟: ①準(zhǔn)確測量每一

19、泳道內(nèi)的分子量內(nèi)標(biāo), 然后依靠內(nèi)標(biāo)繪出分子量的回歸曲線 ②進(jìn)一步確定每個峰的真實性,③對各產(chǎn)物做深入的檢測從而根據(jù)回歸曲線確定每一產(chǎn)物的分子量大小, 并由此轉(zhuǎn)化為片段長度大?、軐Ξa(chǎn)物進(jìn)行孟德爾遺傳模式的校對與檢查⑤確定每一產(chǎn)物的基因型并儲存起來, 以進(jìn)行下一步的分析,基因組掃描綜合分析　 經(jīng)上述處理后的數(shù)據(jù)輸入相應(yīng)的軟件(如LINKAGE等) 進(jìn)行Lod 值的計算,并與家系分析得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合處理,從而得出每一個微衛(wèi)星遺

20、傳標(biāo)志的兩點連鎖分析Lod 值和多點連鎖分析Lod 值,LOD 值(LOD -score) 法 又稱優(yōu)勢對數(shù)法，最初由Haldane 和Smith (1947) 在分析人類控制色盲和血友病的性連鎖基因的重組率時提出?，F(xiàn)在廣泛應(yīng)用于遺傳標(biāo)記之間或遺傳標(biāo)記和單基因控制的質(zhì)量性狀之間連鎖分析。 LOD 值法實際上是一種最大似然分析方法, 只是在求解重組率的最大似然值時不用常規(guī)的數(shù)值迭代法, 而是采用一種變形的格

21、點搜索法,對于單基因病，若某一遺傳標(biāo)志的Lod值大于3, 則可認(rèn)為該遺傳標(biāo)志與致病基因連鎖。這樣即可將致病基因定位于這一染色體的這一區(qū)域內(nèi)；-2 < Lod < 3, 不肯定連鎖； Lod < -2 ，排除連鎖。 而對多基因病來說，若某一遺傳標(biāo)志的Lod 值大于1，則認(rèn)為該遺傳標(biāo)志與致病基因連鎖。,精細(xì)定位 在該區(qū)域內(nèi)選擇覆蓋密度更高的位點及擴(kuò)大家系信息量做進(jìn)一步的連鎖分析,便將這一基因確定于更為

22、狹小的區(qū)域,單倍型分析染色體或染色體區(qū)段上的一組等位基因的特殊組合稱單倍型,SPG-6基因定位及克隆,,SPG-6：D15S128 LOD 值為2.8,,SPG-6家系兩點連鎖分析LOD值結(jié)果 LOD SCORE θ= Marker 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3

23、 0.41. D15S1021 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.742. D15S128 2.92 2.87 2.67 2.41 1.83 1.20 0.553. D15S646 2.48 2.45 2.32 2.13 1.69 1.19 0.634. D15S21

24、0 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.745. D15S122 4.34 4.32 4.15 3.82 2.97 1.94 0.81 6. D15S986 4.04 3.98 3.71 3.36 2.60 1.75 0.827. D15S97 3.42

25、 3.43 3.36 3.18 2.63 1.91 1.02 8. D15S822 -1.02 1.08 1.66 1.74 1.48 1.00 0.459. D15S975 -2.59 -0.31 0.29 0.47 0.51 0.40 0.2210.D15S156 0.04 0.17 0.41

26、 0.52 0.53 0.39 0.1911.D15S1002 -6.72 -2.20 -0.65 -0.05 0.36 0.37 0.22,,,,MarkerD15S1021D15S128D15S646D15S210D15S122D15S986D15S97D15S822D15S975D15S156D15S1002,Band15q11.215q11.215q11.2

27、15q1215q1215q1215q1215q1215q1215q1215q12,Start2256689922681798219000442329914223231090235731592438261524973321250588092558060025523217,End22567048226820922190052423299555232313852357350824382758

28、24973711250590762558093925523454,Position 4.78 6.11 6.11 6.11 6.11 6.92 9.85 12.30 13.06 14.58 14.58,24,382,758bp,,,,測序研究尋找致病基因：定位克隆SPG-6基因定位候選克隆NIPA1(non-imprinted in PWS/AS 1)CH-5

29、20484987bp-20485367bp 預(yù)測是一種跨膜蛋白，具有受體或轉(zhuǎn)運蛋白功能，在進(jìn)化過程中高度保守，在神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá),SPG-6家系兩點連鎖分析LOD值結(jié)果（校正） LOD SCORE θ= Marker 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

30、3. D15S646 2.48 2.45 2.32 2.13 1.69 1.19 0.63 1. D15S1021 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.742. D15S128 2.92 2.87 2.67 2.41 1.83 1.20 0.555. D15S122

31、 4.34 4.32 4.15 3.82 2.97 1.94 0.81 4. D15S210 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.747. D15S97 3.42 3.43 3.36 3.18 2.63 1.91 1.02 6. D15S986 4.04 3.9

32、8 3.71 3.36 2.60 1.75 0.828. D15S822 -1.02 1.08 1.66 1.74 1.48 1.00 0.459. D15S975 -2.59 -0.31 0.29 0.47 0.51 0.40 0.2211.D15S1002 -6.72 -2.20 -0.65 -0.05

33、 0.36 0.37 0.22 10.D15S156 0.04 0.17 0.41 0.52 0.53 0.39 0.19,,,,MarkerD15S541D15S646D15S1021D15S128D15S122D15S210D15S97D15S986D15S822D15S975D15S1002D15S156,Band15q11.215q11.215q

34、11.215q11.215q1215q1215q1215q1215q1215q1215q1215q12,Start204593092190004422566899226817982323109023299142243826152357315924973321250588092552321725580600,End2045968521900524225670482268209223231

35、38523299555243827582357350824973711250590762552345425580939,Position 6.11 4.78 6.11 6.11 6.11 9.85 6.92 12.30 13.06 14.58 14.58,22,567,048- 20,459,309=2,107,739bp,染色體畸變斷裂點精細(xì)定位

36、 克隆致病或易感基因 染色體畸變定位和克隆致病基因是應(yīng)用最早的方法之一，但報道較少。平衡型染色體結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w重排斷裂點精細(xì)定位克隆致病基因的方法再次被重用，得益于人類基因組計劃的進(jìn)行和完成及基因組重疊克隆群的建立 。,利用酵母人工染色體(PAC)或細(xì)菌人工染色體BAC重疊克隆作探針，進(jìn)行染色體原位雜交(ISH)或熒光原位雜交(FISH)- 染色體步移，確定平衡型染色體結(jié)構(gòu)畸變斷裂點的具體

37、位置，位置克隆斷裂所影響的基因。該方法在單基因多基因病易感基因克隆中應(yīng)用已呈現(xiàn)出誘人的前景。,,利用平衡型染色體異常重排斷裂點分子作圖方法克隆致病基因是最早應(yīng)用于致病基因定位和克隆的方法之一，1985年，Ray 等通過對攜帶X-常染色體易位女性DMD病人的染色體斷裂點作圖確定了該基因并最終克隆。該方法的優(yōu)勢是效率高，不需要大樣本或大家系，經(jīng)常通過一例平衡型染色體異常病例的重排斷裂點分子作圖就能克隆一個候選易感基因。,關(guān)鍵：選擇新發(fā)平

38、衡型染色體重排伴特定表型異常病例。盡可能排除隱藏的亞顯微水平異常。染色體異常斷裂點定位要盡量精細(xì)、準(zhǔn)確。,孤獨癥伴inv(5) (p13q13)病例 斷裂點精細(xì)作圖,臨床表現(xiàn)： 患者女，6歲，39周順產(chǎn)，出生體重2750g，母親在孕期和患者出生時的情況正常。14個月學(xué)走路，因2歲時不會說話，各方面比同齡兒差就診。智力低下，IQ=48；現(xiàn)仍不會說話。,對周圍事物不感興趣，眼睛與人沒有交流，沒有對視現(xiàn)象，

39、膽怯，不愿和其他人玩，獨自一人自娛自樂，在不同時期對不同玩具或物品有依戀現(xiàn)象,不能也不愿與人交流。2歲內(nèi)有過4次癲癇發(fā)作史。視覺和聽覺正常,頭部核磁共振（MRI）未發(fā)現(xiàn)異常。家族中沒有與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的異常病史。,p13.1q13.3,,,,,,,,,,,,p13.1, q13.3q13.3, p13.1,,,正常5號染色體,Inv(5),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

40、,,,,,,,ACTGGTCAATGCAG,TGCACTGGTCAAAG,,,,ACTGGTCGTCACGT,GACGTAAGTCAAAG,,,,,,,,,,,,,,inv(5)(p13q13) BAC克隆FISH-染色體步移結(jié)果,5p14.3 RP11-973N21: 19970381-20174363 未倒位5p14.3 RP11-989D21:

41、21618251-21804568 未倒位5p14.3 RP11-348C235: 22843498-23005852 半倒位5p14.3 RP11-280O13: 22883380-23058380 半倒位5p14.1 RP11-143G19: 25266683-25425310 倒位5p13.3 RP11-938E3: 29652592-29860143 倒位,5q13.3 RP11-

42、739H23: 74827700-75012774 倒位5q14.3 RP11-1005F23: 87832522-88019374 倒位5q14.3 RP11-153K7: 88547863-88682442 半倒位5q14.3 RP11-276J11: 88605605-88775389 半倒位5q14.3 RP11-1071C2: 88850996-89058393 未倒位5q15

43、RP11-450M18 : 96225280-96427302 未倒位,,,,,,MR伴t(3;18)(p13;q23)病例 斷裂點精細(xì)作圖,臨床表現(xiàn)： 患者7歲，足月剖腹產(chǎn)，出身體重4.1kg,無窒息、核黃膽和高熱抽搐史，10個月獨坐,1歲會爬，2歲會走。近4歲叫爸爸媽媽，7歲仍不會說連貫性語言，好動，注意力不集中，當(dāng)時上幼兒園中班，不會寫字，耳大。13歲仍只能說簡單語言，不能上學(xué)，但生活能自理,,染色體

44、核型分析：染色體G顯帶核型：46,XX,inv(5)(p13q13)高分辯核型： 46,XX,inv(5)(p13.1q13.3)雙親核型正常,染色體核型分析：染色體G顯帶核型： 46,XY,t(3;18)(p13;q23)高分辯核型： 46,XY,t(3;18)(p13;q22.3)雙親核型正常,,,,,,,3,der (3),18,der (18),p13,q22.3,,Chr18,3p14.1 RP1

45、1-937H3: 67605026- 67816431 3p14.1 RP11-690K16: 69403279-69589135 3p13 RP11-120G9: 70496973-70674836 3p13 RP11-806H15: 70635936-70827471 3p13 RP11-10B21: 70822800-70980695 3p13 RP11-79P21: 70933260-

46、71108032 3p13 RP11-905F6: 71256411-71475547 3p13 RP11-69L8: 71572153- 71733818 3p13 RP11-662O21:71755387- 71920750 3p13 RP11-134C17:72003432- 72173010,,18q22.3 RP11-455M13: 71535950- 7175118218q2

47、2.2 RP11-1013D3: 72337190-72516913 18q22.3 RP11-136M16: 72381857-7255061818q22.3 RP11-460I23: 72397229-72598462 18q22.3 RP11-141I4: 72563794-72713679 18q22.3 RP11-62B21: 72669558-72838472 18q22.3 RP11-695P1:

48、72829619-73030606 18q23 RP11-1043O21:73348664- 73520584 18q23 RP11-1021L11: 73952626- 74128551,,,,Chr3,易位易位易位跨越斷裂點跨越斷裂點未易位未易位未易位未易位未易位,未易位未易位未易位跨越斷裂點易位易位易位易位易位,重疊克隆FISH縮小斷裂點區(qū)域,,Maximum range of br

49、eakpoint,Potential minimum region of breakpoint,,,35kb,,Maximum range of breakpoint,Potential minimum region of breakpoint,30kb,,,,在此范圍內(nèi)，根據(jù)染色體易位后DNA序列發(fā)生排列改變的原理，參照兩個跨越斷裂點片段的序列信息，設(shè)計和重新組合引物，進(jìn)行Long-Range PCR，最終將斷裂點精細(xì)定位于3號

50、染色體的無基因區(qū)域和18號染色體的ZNF407基因的第三內(nèi)含子內(nèi)。,long-range PCR引物設(shè)計 根據(jù)long-range PCR試劑盒特點設(shè)計合適擴(kuò)增長度引物 所有引物都能相互配對，包括復(fù)性溫度相近，不會形成二聚體,,,,,,,,der 3,相互易位,,,,,,,L18q-1FL18q-1RL18q-2FL18q-2RL18q-3FL18q-3R,p13,q22.3,der 18,3,18,L3p-1F

51、L3p-1RL3p-2FL3p-2RL3p-3FL3p-3R,,,long-range PCR擴(kuò)增 引物正常配對進(jìn)行l(wèi)ong-range PCR擴(kuò)增，驗證引物設(shè)計的效果 根據(jù)染色體重排的類型，將不同染色體上的上下游引物配對，反復(fù)進(jìn)行異配long-range PCR擴(kuò)增及測序,,,,1000bp,750bp,M 1 2 3 4 M,M: DNA size marker; 1. Negative c

52、ontrol ; 2.PCR products covering the breakpoint region of derivative chromosome 3; 3: PCR products covering the breakpoint region of derivative chromosome 18; 4: Negative control.,,,,,,Chromosome 3nucleotide position

53、70789412-70789414,Chromosome 18nucleotide position72547016-72547018,der chromosome 3,,,,,Chromosome 18nucleotide position72547010-72547012,Chromosome 3nucleotide position 70789408-70789410,der chromosome 18,,,Chr1

54、8(+) TGTTGACCACATCAGCCTCGAAGAGCTTCCCTAGGAAAGCTGTDer18(+) TGTTGACCACATCAGCCT TTGATTCTTTTGTACAAATGDer3 ( - ) CCAAGGCATTCTTGGGTT GAGCTTCCCTAGGAAAGCTGTChr3 ( - ) CCAAGGCATTCTTGGGTTGATACTTTGATTCTTTT

55、GTACAAATG,3號染色體缺失2～6個堿基；18號染色體缺失4～8個堿基,,ZNF407基因是鋅指蛋白基因家族的一員，編碼的鋅指蛋白通過與DNA、RNA的特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。 在已報道的智力低下相關(guān)基因中，有6個編碼鋅指蛋白的基因。 其中已確定的有ZNF81、 ZNF592、ZNF674 ， 有待確定的有ZNF741 、ZNF462、ZNF261。,,根據(jù)確定新候選致病基因的原則，我

56、們將ZNF407基因確定為智力低下的新候選致病基因。,,為了確定ZNF407基因與ID的關(guān)系，我們挑選105例與智力低下伴新發(fā)t(3;18)(p13;q22.3)易位病例具有相似臨床癥狀的不明原因的智力低下患者，進(jìn)行外顯子、外顯子-內(nèi)含子接頭區(qū)以及5’UTR區(qū)、3’UTR區(qū)PCR擴(kuò)增和測序分析。 200例年齡、性別相匹配正常人為對照組。,,通過與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了兩個新的保守氨基酸位點錯義突變c.1436A>G (

57、Y460C ) ,酪氨酸被半胱氨酸替代；c.3640C>G (P1195A),脯氨酸被丙氨酸替代。 200例正常對照及突變患者雙親未發(fā)現(xiàn)ZNF407基因的錯義突變。 保守性分析 460位點高度保守，1195位點中度保守，在Gallus由P變?yōu)锳。,,c.1436A>Gp.Tyr460Cys,,,c.3640C>Gp.Pro 1195Ala,,,Homo sapiensBos TaurusMus m

58、usculusCanis lupus familiarisEquus caballusGallus gallusMonodelphisNomascus leucogenysSus scrofa,,Homo sapiensBos TaurusMus musculusCanis lupus familiarisEquus caballusGallus gallusMonodelphisNomascus leucog