固相合成基礎(chǔ) spps

1、Page1of43一、多、多肽合成概論1多肽化學(xué)合成概述：多肽化學(xué)合成概述：1963年，R.B.Merrifield［1］創(chuàng)立了將氨基酸的C末端固定在不溶性樹脂上，然后在此樹脂上依次縮合氨基酸，延長肽鏈、合成蛋白質(zhì)的固相合成法，在固相法中，每步反應(yīng)后只需簡單地洗滌樹脂，便可達(dá)到純化目的.克服了經(jīng)典液相合成法中的每一步產(chǎn)物都需純化的困難，為自動化合成肽奠定了基礎(chǔ).為此，Merrifield獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎.今天，固相法得到了很大

2、發(fā)展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又發(fā)展了Fmoc固相法(Fmoc:9芴甲氧羰基).以這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善.Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脫除的Boc為α氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類.合成時將一個Boc－氨基酸衍生物共價交聯(lián)到樹脂上，用TFA脫除Boc，用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過Dcc活化

3、、耦聯(lián)下一個氨基酸，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了許多生物大分子，如活性酶、生長因子、人工蛋白等.多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成。到現(xiàn)在，人們已發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種存在于人體的肽，對于多肽的研究和利用，出現(xiàn)了一個空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價

4、值。通過多肽全合成可以驗(yàn)證一個新的多肽的結(jié)構(gòu)；設(shè)計(jì)新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。多肽的化學(xué)合成技術(shù)無論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來，固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便于計(jì)算機(jī)控制、便于普及推廣的突出優(yōu)勢而成為肽合成的常規(guī)方法并擴(kuò)展到核苷酸合成等其它有機(jī)物領(lǐng)域。本文概述了固相合成的基本原理、實(shí)驗(yàn)過程，對其現(xiàn)狀進(jìn)行分析并展望了今后的發(fā)展趨勢。從196

5、3年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度

6、，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為BOC固相合成法，α氨基用FMOC（9芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為FMOC固相合成法，2固相合成的基本原理固相合成的基本原理Page3of43溫度下，直接同樹脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如二氧六環(huán)、DMF或DMSO中反應(yīng)；羧基樹脂，則通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護(hù)氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹脂或酰肼型樹脂，

7、卻是加入適當(dāng)?shù)目s合劑如DCC后，通過保護(hù)氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基因也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護(hù)基，因?yàn)檫@樣不易發(fā)生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強(qiáng)的酸解條件才能脫除，所以后來

8、改為叔丁氧羰基（BOC）保護(hù)，用TFA（三氟乙酸）脫保護(hù)，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類的合成。1978年，changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino報(bào)道的Fmoc(9芴甲氧羰基)作為α氨基保護(hù)基，F(xiàn)moc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌啶CH2CL2或哌啶DMF脫去，近年來，F(xiàn)moc合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉(zhuǎn)變?yōu)殡乱员阌?/p>

9、于片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側(cè)鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時保護(hù)起來。保護(hù)基的選擇既要保證側(cè)鏈基團(tuán)不參與形成酰胺的反應(yīng)，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護(hù)半胱氨酸的S，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環(huán)用222三氟1芐氧羰基和222三氟1叔丁氧

10、羰基乙基保護(hù)，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護(hù)，用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應(yīng)原理與液相中的基本一致，將兩個相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBTDCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應(yīng)用最廣。裂解及合成肽鏈的純化BO

11、C法用TFAHF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。4固相合成的特點(diǎn)及存在的主要問題固相合成的特點(diǎn)及存在的主要問題固相合成法對于肽合成的顯著的優(yōu)點(diǎn)：簡化并加速了多步驟的合成；因反應(yīng)在一簡單反應(yīng)器皿中便可進(jìn)行，可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失；固相載體共價相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理