Pleurotus eryngii-co007產(chǎn)木質(zhì)素降解酶條件的優(yōu)化及對染料降解的研究.pdf

1、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)是一種具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的白腐真菌，隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、真擔(dān)子菌綱、層菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬。木質(zhì)素降解酶是參與木質(zhì)素生物降解過程中的酶類，具有高氧化降解能力和多底物性，能夠降解木質(zhì)素、多環(huán)芳烴類化合物、雜環(huán)類化合物和合成染料等多種難降解有機(jī)物。本文對Pleurotus eryngii-Co007木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化、并對其酶學(xué)性質(zhì)和染料降解效果開展系統(tǒng)研究，為今

2、后將其應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、生物漂白與制漿、食品工業(yè)等領(lǐng)域提供理論和實(shí)踐依據(jù)。
　　 通過初始pH、秸稈、吐溫-80和銅離子的單因素實(shí)驗(yàn)和中心組合響應(yīng)面優(yōu)化考察了影響Pleurotus eryngii-C0007菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的因素，得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的最佳條件。在此基礎(chǔ)上，開展3L上罐參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果表明在25℃，150r/min,0.8vvm溶氧的條件下，培養(yǎng)10天，發(fā)酵液中酶活最高達(dá)到691.04U/mL，較搖瓶培養(yǎng)提

3、高了1.86倍。同時對Pleurotus eryngii-C0007菌絲體的再次利用產(chǎn)木質(zhì)素降解酶進(jìn)行了研究，在pH5.8的緩沖體系，菌絲體產(chǎn)酶效果最好，能再利用兩次。菌絲體在三次利用的緩沖液體系，酶活最高可達(dá)到565.04U/mL。
　　 為了提高割膠純化的回收率，分析了超聲處理對Native-PAGE中活性目標(biāo)蛋白回收的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法的Central Composite進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到的最佳超聲

4、條件為超聲時間188.40min、超聲功率76.31W。在此條件下，Native-PAGE中活性目標(biāo)蛋白回收率達(dá)40.03％，與回歸模型的預(yù)測值相對誤差僅1.11％，回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。
　　 對Pleurotus eryngii-C0007木質(zhì)素降解酶粗酶及單一組分芳基乙醇酶AAO-Pec0007的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察。以ABTS為底物，刺芹側(cè)耳木質(zhì)素降解酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)如下：最適催化pH為3.0，在pH為4.0時穩(wěn)定性

5、最好，殘余酶活高達(dá)91.8％；最適催化溫度為15℃，最適穩(wěn)定溫度為10℃；Zn2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+對粗酶的催化有一定的促進(jìn)作用，Mn2+的促進(jìn)作用最大；K+、Ca2+、Ag+、Na+、Fe2+、Mg2+對粗酶的催化有一定的抑制，F(xiàn)e2+的抑制最強(qiáng)；氧化ABTS的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為714.29U/mg和1.5mM。以VA為底物，AAO-Pec0007的酶學(xué)性質(zhì)如下：最適催化pH為6.0，在pH為7.4時穩(wěn)定性最好

6、，殘余酶活高達(dá)93％;最適催化溫度為70℃，最適穩(wěn)定溫度為20℃；測試金屬離子沒有促進(jìn)作用，其中的Zn2+、Fe2+、Cu2+這三種金屬離子對AAO-Peco007酶活力有明顯抑制作用；氧化VA的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為80U/mg和0.921mM。
　　 采用Pleurotus eryngii-C0007木質(zhì)素降解酶粗酶對四種不同類型的染料進(jìn)行脫色試驗(yàn)，結(jié)果表明溴酚藍(lán)＞剛果紅＞靛藍(lán)＞亞甲基藍(lán)。對脫色影響因素進(jìn)行研究，以2

7、h染料脫色體系為例，在脫色溫度30℃、pH4.0、H2O25μmol/L、粗酶濃度20U/mL、溴酚藍(lán)濃度10mg/L的條件下，溴酚藍(lán)脫色效率最高，脫色率為89.56％，小分子介體物質(zhì)ABTS對溴酚藍(lán)脫色體系脫色率無促進(jìn)；在脫色溫度30℃、pH4.6、H2O210μmol/L、ABTS2.5μmol/L、粗酶濃度20U/mL、靛藍(lán)濃度100mg/L的條件下，靛藍(lán)脫色效率最高，脫色率為50.47％;在脫色溫度40℃、pH4.8、H2O22

8、.5μmol/L、ABTS2.5μmol/L、粗酶濃度20U/mL、剛果紅濃度100mg/L的條件下，剛果紅脫色效率最高，脫色率為54.72％;對亞甲基藍(lán)染液的脫色率在24h時達(dá)到10.12％。
　　 采用AAO.Peco007單一組分對四種不同染料進(jìn)行脫色試驗(yàn)，結(jié)果表明剛果紅＞溴酚藍(lán)＞靛藍(lán)＞亞甲基藍(lán)(亞甲基藍(lán)不分解)。對脫色影響因素進(jìn)行研究：以2h染料脫色體系為例，在脫色溫度40℃、pH4.2、H2O210μmol/L、AAO

9、. Pec0007濃度20U/mL、溴酚藍(lán)濃度10mg/L的條件下，溴酚藍(lán)脫色效率最高，脫色率為25.69％，小分子介體物質(zhì)ABTS對溴酚藍(lán)脫色體系脫色率無促進(jìn)；在脫色溫度30℃、pH4.2、H2O210μmol/L、ABTS2.5μmol/L、AAO-Pec0007濃度20U/mL、靛藍(lán)濃度100mg/L的條件下，靛藍(lán)脫色效率最高，脫色率為24.57％;在脫色溫度40℃、pH5.2、H2O22.5μmol/L、ABTS2.5μmol/

10、L、AAO-Peco007濃度20U/mL、剛果紅濃度100mg/L的條件下，剛果紅脫色效率最高，脫色率為48.31％。
　　 在上述基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)的響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化Pleurotus eryngii-C0007木質(zhì)素降解酶粗酶對蒽醌類染料靛藍(lán)和偶氮類染料剛果紅脫色條件，結(jié)果表明在pH4.60、30℃、ABTS2.85μmol/L的條件下，木質(zhì)素降解酶粗酶對靛藍(lán)的的脫色率為49.98％;在pH4.81、