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文檔簡介
1、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)是一種具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的白腐真菌,隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、真擔(dān)子菌綱、層菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬。木質(zhì)素降解酶是參與木質(zhì)素生物降解過程中的酶類,具有高氧化降解能力和多底物性,能夠降解木質(zhì)素、多環(huán)芳烴類化合物、雜環(huán)類化合物和合成染料等多種難降解有機(jī)物。本文對Pleurotus eryngii-Co007木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化、并對其酶學(xué)性質(zhì)和染料降解效果開展系統(tǒng)研究,為今
2、后將其應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、生物漂白與制漿、食品工業(yè)等領(lǐng)域提供理論和實(shí)踐依據(jù)。
通過初始pH、秸稈、吐溫-80和銅離子的單因素實(shí)驗(yàn)和中心組合響應(yīng)面優(yōu)化考察了影響Pleurotus eryngii-C0007菌株產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的因素,得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的最佳條件。在此基礎(chǔ)上,開展3L上罐參數(shù)優(yōu)化,結(jié)果表明在25℃,150r/min,0.8vvm溶氧的條件下,培養(yǎng)10天,發(fā)酵液中酶活最高達(dá)到691.04U/mL,較搖瓶培養(yǎng)提
3、高了1.86倍。同時對Pleurotus eryngii-C0007菌絲體的再次利用產(chǎn)木質(zhì)素降解酶進(jìn)行了研究,在pH5.8的緩沖體系,菌絲體產(chǎn)酶效果最好,能再利用兩次。菌絲體在三次利用的緩沖液體系,酶活最高可達(dá)到565.04U/mL。
為了提高割膠純化的回收率,分析了超聲處理對Native-PAGE中活性目標(biāo)蛋白回收的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面分析法的Central Composite進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),得到的最佳超聲
4、條件為超聲時間188.40min、超聲功率76.31W。在此條件下,Native-PAGE中活性目標(biāo)蛋白回收率達(dá)40.03%,與回歸模型的預(yù)測值相對誤差僅1.11%,回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。
對Pleurotus eryngii-C0007木質(zhì)素降解酶粗酶及單一組分芳基乙醇酶AAO-Pec0007的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察。以ABTS為底物,刺芹側(cè)耳木質(zhì)素降解酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)如下:最適催化pH為3.0,在pH為4.0時穩(wěn)定性
5、最好,殘余酶活高達(dá)91.8%;最適催化溫度為15℃,最適穩(wěn)定溫度為10℃;Zn2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+對粗酶的催化有一定的促進(jìn)作用,Mn2+的促進(jìn)作用最大;K+、Ca2+、Ag+、Na+、Fe2+、Mg2+對粗酶的催化有一定的抑制,F(xiàn)e2+的抑制最強(qiáng);氧化ABTS的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為714.29U/mg和1.5mM。以VA為底物,AAO-Pec0007的酶學(xué)性質(zhì)如下:最適催化pH為6.0,在pH為7.4時穩(wěn)定性最好
6、,殘余酶活高達(dá)93%;最適催化溫度為70℃,最適穩(wěn)定溫度為20℃;測試金屬離子沒有促進(jìn)作用,其中的Zn2+、Fe2+、Cu2+這三種金屬離子對AAO-Peco007酶活力有明顯抑制作用;氧化VA的動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km分別為80U/mg和0.921mM。
采用Pleurotus eryngii-C0007木質(zhì)素降解酶粗酶對四種不同類型的染料進(jìn)行脫色試驗(yàn),結(jié)果表明溴酚藍(lán)>剛果紅>靛藍(lán)>亞甲基藍(lán)。對脫色影響因素進(jìn)行研究,以2
7、h染料脫色體系為例,在脫色溫度30℃、pH4.0、H2O25μmol/L、粗酶濃度20U/mL、溴酚藍(lán)濃度10mg/L的條件下,溴酚藍(lán)脫色效率最高,脫色率為89.56%,小分子介體物質(zhì)ABTS對溴酚藍(lán)脫色體系脫色率無促進(jìn);在脫色溫度30℃、pH4.6、H2O210μmol/L、ABTS2.5μmol/L、粗酶濃度20U/mL、靛藍(lán)濃度100mg/L的條件下,靛藍(lán)脫色效率最高,脫色率為50.47%;在脫色溫度40℃、pH4.8、H2O22
8、.5μmol/L、ABTS2.5μmol/L、粗酶濃度20U/mL、剛果紅濃度100mg/L的條件下,剛果紅脫色效率最高,脫色率為54.72%;對亞甲基藍(lán)染液的脫色率在24h時達(dá)到10.12%。
采用AAO.Peco007單一組分對四種不同染料進(jìn)行脫色試驗(yàn),結(jié)果表明剛果紅>溴酚藍(lán)>靛藍(lán)>亞甲基藍(lán)(亞甲基藍(lán)不分解)。對脫色影響因素進(jìn)行研究:以2h染料脫色體系為例,在脫色溫度40℃、pH4.2、H2O210μmol/L、AAO
9、. Pec0007濃度20U/mL、溴酚藍(lán)濃度10mg/L的條件下,溴酚藍(lán)脫色效率最高,脫色率為25.69%,小分子介體物質(zhì)ABTS對溴酚藍(lán)脫色體系脫色率無促進(jìn);在脫色溫度30℃、pH4.2、H2O210μmol/L、ABTS2.5μmol/L、AAO-Pec0007濃度20U/mL、靛藍(lán)濃度100mg/L的條件下,靛藍(lán)脫色效率最高,脫色率為24.57%;在脫色溫度40℃、pH5.2、H2O22.5μmol/L、ABTS2.5μmol/
10、L、AAO-Peco007濃度20U/mL、剛果紅濃度100mg/L的條件下,剛果紅脫色效率最高,脫色率為48.31%。
在上述基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)的響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化Pleurotus eryngii-C0007木質(zhì)素降解酶粗酶對蒽醌類染料靛藍(lán)和偶氮類染料剛果紅脫色條件,結(jié)果表明在pH4.60、30℃、ABTS2.85μmol/L的條件下,木質(zhì)素降解酶粗酶對靛藍(lán)的的脫色率為49.98%;在pH4.81、
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