elisa知識講座

1、ELISA知識講座知識講座免疫檢測的基礎(chǔ)知識免疫檢測的基礎(chǔ)知識ELISA是一種免疫測定。免疫測定（immunoassay，IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗(yàn)中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。1.1抗原抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗原進(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病

2、毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的，稱為半抗原（hapten）。例如某些激素、藥物等?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇（antigenicdeterminant），或稱為表位（epitope）。一個抗原分子可帶有不同的決定簇，例如中可帶有等決定簇。1.2抗體1.2.1抗體的結(jié)構(gòu)抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulinIg)。Ig分五類，即Ig

3、G、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤?，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。IgG的結(jié)構(gòu)見圖。①木瓜酶裂解部位②胃蛋白酶裂解部位重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示

4、。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合（見圖），是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）。每個Fab都保存結(jié)合抗原的能力，但只有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價的，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab）2，能和兩個相同的抗原結(jié)合；另一片

5、段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的

6、。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗αhCG和抗βhCG兩種抗體，抗αhCG抗體將與LH中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗(yàn)中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達(dá)到50mIumlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗βhCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。1.3.4敏感性在測定血清中某一物質(zhì)的含量

7、時，化學(xué)比色法的敏感度為mgml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μgml，免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ngml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ngml。1.4免疫測定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍

8、極廣，在臨床檢驗(yàn)中可用于測定：1)體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。2)激素，包括小分子量的甾體激素等。3)抗生素和藥物。4)病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。5)另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗HBs等。5標(biāo)記的免疫測定如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)5~10μgml，但在臨床檢驗(yàn)中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增

9、加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物徹底反應(yīng)。以標(biāo)記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應(yīng)式如下：AgAb※→AgAb※Ab※在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和

10、Ab※，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)行。6酶免疫測定酶免疫測定（enzymeimmunoassay）可分為均相（homogenous）

11、和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相EIA需先進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme