血漿中藥物分析實(shí)驗(yàn)第一部分

1、生物樣品中藥物分析,,,一、生物樣品中藥物分析的性質(zhì)和意義二、生物樣品中藥物分析的對(duì)象和特點(diǎn)三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,,一、生物樣品中藥物分析的性質(zhì)和意義（一）生物樣品中藥物分析的性質(zhì)（二）生物樣品中藥物分析的意義,（一）生物樣品中藥物分析的性質(zhì),生物樣品藥物分析，又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是隨著臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要而建立起來的一門新興學(xué)科。,,生物樣品藥物分析，旨在通過各種分析手段，了

2、解藥物在生物樣品內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量變化。獲得藥物代謝動(dòng)力學(xué)的各種參數(shù)、藥物在生物樣品內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化、代謝的方式和途徑等信息。從而為藥品生產(chǎn)、臨床醫(yī)療、實(shí)驗(yàn)研究等方面對(duì)研究中的藥物作出估計(jì)與評(píng)價(jià)，對(duì)藥物的改進(jìn)與發(fā)展作出貢獻(xiàn)。,（二）生物樣品中藥物分析的意義,1.新藥評(píng)價(jià)和新藥開發(fā)中的意義大量事實(shí)證明，如無臨床藥理學(xué)和臨床藥學(xué)研究給新藥以確切的評(píng)價(jià)，要做到臨床安全、合理、有效地用藥將會(huì)遇到許多困難。因此，加強(qiáng)藥物在生物樣品內(nèi)作用機(jī)理的研究

3、，以了解和闡明藥物結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、劑型及生產(chǎn)工藝與藥物療效等關(guān)系，已成為評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量的重要內(nèi)容和依據(jù)。,2.在臨床合理用藥中的意義影響血藥濃度的因素很多，同一種給藥方案難以對(duì)每一個(gè)病人都達(dá)到理想的治療效果。為達(dá)到用藥安全、合理、有效，必須設(shè)計(jì)個(gè)體化給藥方案，就需要做好對(duì)治療藥物監(jiān)測(cè)，以血藥濃度為指標(biāo)，達(dá)到個(gè)體化用藥。,課堂活動(dòng),《地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)２３３例結(jié)果分析》請(qǐng)閱讀該文獻(xiàn)后，回答下列問題（以小組為單位，上交討論結(jié)果）：為什

4、么要進(jìn)行地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)？影響地高辛療效的因素有哪些？,,一、生物樣品中藥物分析的性質(zhì)和意義二、生物樣品中藥物分析的對(duì)象和特點(diǎn)三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,,二、生物樣品中藥物分析的對(duì)象和特點(diǎn)（一）生物樣品中藥物分析的對(duì)象（二）生物樣品中藥物分析的特點(diǎn),（一）生物樣品中藥物分析的對(duì)象,凡是生物樣品內(nèi)藥物到達(dá)之處，如體液、器官、組織、排泄物等都是分析的對(duì)象。所以生物樣品內(nèi)藥物分析的樣本有血液、尿液、唾液、

5、膽汁、淋巴液、淚液、脊髓液、汗液、乳汁、各種器官以及呼出的氣體等。,,生物樣品內(nèi)藥物分析的目標(biāo)，不僅是母體藥物也包括代謝產(chǎn)物。因?yàn)榇x產(chǎn)物常具有生理活性，弄清它們的種類、結(jié)構(gòu)、數(shù)量及分布情況，可了解藥物在生物體內(nèi)的變化及消除規(guī)律，這對(duì)安全用藥和正確評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量也是非常重要的。,,由于新藥進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前，或者對(duì)已上市藥在某一方面的重新評(píng)價(jià)，一般要求先在動(dòng)物體上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以生物樣品內(nèi)藥物分析對(duì)象不僅是人體，也包括動(dòng)物體。,（二）生物樣

6、品中藥物分析的特點(diǎn),與常規(guī)藥物分析相比，生物樣品內(nèi)藥物分析在靈敏度和選擇性等方面有較高的要求。微量藥物存在于大量生物介質(zhì)中，樣品中含內(nèi)源性干擾雜質(zhì)，這些干擾物質(zhì)又隨疾病情況不同而有所不同。,,很多藥物在生物樣品內(nèi)經(jīng)過代謝可產(chǎn)生一種或多種代謝物，母體藥物和代謝物又能同生物大分子結(jié)合。這一切給藥物分離、分析帶來困難，這就要求分析方法具有更高的選擇性。,,另外，在生物樣品中，藥物濃度都很低，一般血藥濃度在10-6-10-9g/ml之間。

7、且生物樣品若為血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有較高的靈敏度。,,一、生物樣品中藥物分析的性質(zhì)和意義二、生物樣品中藥物分析的對(duì)象和特點(diǎn)三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,血液(血漿、血清)：體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系——最常用的生物樣品。,,血液（blood）血液中藥物濃度可以較好地體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系。是最為常用的生物樣品。分為全血、血漿和血清。,全血、血漿和血清的區(qū)別,全血：血

8、液經(jīng)抗凝處理后的全部血液。血漿：離心除去血細(xì)胞后所得到的淡黃色液體。血清：如血液不經(jīng)抗凝處理，讓其自行凝固，則在抽血后的一段時(shí)間內(nèi)，血液會(huì)自動(dòng)在一系列凝血因子的作用下發(fā)生凝集，血液首先凝固成一個(gè)整體，再經(jīng)過一段時(shí)間或用離心機(jī)離心，血液中凝固的部分會(huì)與一些清澈淡黃色的液體分離開，這些液體稱為血清。,血漿和血清的區(qū)別,血清與血漿從表面上看似乎沒有什么不同，但其內(nèi)在的主要區(qū)別是血清中不含纖維蛋白原，是未經(jīng)抗凝處理過的血液凝固后得到的。,,

9、1. 血樣的采集：一般用注射器直接采集靜脈血，每次1~5ml；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，采血量不宜超過動(dòng)物總血量的十分之一。,,,,,,2. 血樣的制備測(cè)定血中藥物的濃度，通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。,,血漿的制備采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500~3000r/min離心5~10min使與血細(xì)胞分離，所得淡黃色上清液即為血漿（ plasma ） 。抗凝劑—最常用的是肝素（heparin）

10、。其它抗凝劑EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等。,,3.血樣的應(yīng)用：藥物動(dòng)力學(xué)生物利用度臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè),,尿液—用于藥物劑量回收、尿清除率、生物 利用度、內(nèi)源性活性物質(zhì)、藥物代謝分型及代謝物等的研究測(cè)定。,毛發(fā)—用于藥物濫用監(jiān)測(cè)及微量元素測(cè)定。肝、胃、腎、肺、腦等臟器組織—?jiǎng)游镌囼?yàn)研究藥物吸收、分布狀態(tài)及服藥過量中毒死亡。,生物樣品的貯存與處理,冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1-2d) 冷凍—冷柜(-20℃)或低

11、溫冷柜(-80℃)，中長(zhǎng)期保存。冷藏或冷凍時(shí)限經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定。,,血樣的貯存：采集后及時(shí)分離血漿和血清（≤2h），分離后再貯存若不予先分離，血凝后冰凍保存，則因冰凍有時(shí)易引起細(xì)胞溶解，會(huì)阻礙血漿或血清的分離。,,注意事項(xiàng)：冷凍的樣品測(cè)定時(shí)，需臨時(shí)解凍。解凍后的樣品應(yīng)一次性測(cè)定完畢，不應(yīng)反復(fù)凍融。如果采集的樣品不能一次性測(cè)定，則應(yīng)以小體積分裝貯存，每次按計(jì)劃取一定數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。,,一、生物樣品中藥物分析的性質(zhì)和意義二、生

12、物樣品中藥物分析的對(duì)象和特點(diǎn)三、生物樣品的種類四、生物樣品分離、純化與濃集,,生物樣品的預(yù)處理技術(shù)：分離、純化、富集或化學(xué)衍生化等，目的是為藥物的最終測(cè)定創(chuàng)造良好的條件。分離——消除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物或其它共存藥物的干擾純化與濃集——提高被測(cè)藥物的靈敏度樣品經(jīng)分離、純化與濃集與測(cè)定方法相結(jié)合，達(dá)到專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好。,,樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)。也是分析中最困難、最繁雜的工作。對(duì)于生物樣品的

13、預(yù)處理很難規(guī)定固定的程序和方式，必須結(jié)合測(cè)定實(shí)際和要求，采取恰當(dāng)?shù)姆椒ê图夹g(shù)。,（一）生物樣品預(yù)處理的目的,①使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放測(cè)定藥物的總濃度②使樣品純化消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾③提高檢測(cè)靈敏度適應(yīng)和符合測(cè)定方法要求的靈敏度④防止分析儀器的污染提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果,①使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放,藥物在體內(nèi)存在形式：游離型藥物 代謝物 藥物或代謝物與蛋白結(jié)合物 預(yù)處理：藥物或代謝

14、物從“結(jié)合物”或綴合物中釋放，測(cè)定藥物或代謝物的總濃度。,②樣品純化,生物樣品的基質(zhì)——組成復(fù)雜、干擾多例如：血清：含有高分子的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、尿素等有機(jī)物，也含有Na+、K+、Cl-等無機(jī)物。尿液：含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等。藥物組分：藥物含量低，一般為“微克”或“納克”水平，經(jīng)預(yù)處理使藥物純化、富集，以利于進(jìn)一步檢測(cè)。,③提高檢測(cè)靈敏度,預(yù)處理—降低背景噪音—提高靈敏度特異性強(qiáng)、靈

15、敏度高的分析方法預(yù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單 不具備分離功能的方法(光譜法)預(yù)處理十分重要,④防止分析儀器的污染,生物樣品基質(zhì)中脂肪、蛋白質(zhì)、不溶性顆粒會(huì)污染分析儀器。因此，應(yīng)根據(jù)分析儀器的耐受程度，選擇恰當(dāng)?shù)念A(yù)處理方法。,,舉 例應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)血藥濃度，進(jìn)行樣品預(yù)處理的作用。,,去除血漿（或血清）中的蛋白質(zhì)延長(zhǎng)色譜柱的壽命（去除固體雜質(zhì)）改善選擇性（排除生物基質(zhì)的干擾）改善組分可測(cè)性（被測(cè)組分的富集）改善組分色譜行為

16、（化學(xué)衍生化）,生物樣品的預(yù)處理方法,有機(jī)破壞法去除蛋白質(zhì)法溶劑萃取法綴合物的水解法化學(xué)衍生化法,去除蛋白質(zhì)法,可使結(jié)合型藥物釋放去除蛋白后取上清液直接分析測(cè)定去除蛋白后取上清液經(jīng)進(jìn)一步分離、純化、濃集后分析測(cè)定。,去除蛋白質(zhì)的方法,1.加入與水混溶的有機(jī)溶劑—蛋白質(zhì)脫水沉淀2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)3.加入強(qiáng)酸—與蛋白質(zhì)陽離子(銨基) 形成不溶性鹽沉淀,去除蛋白質(zhì)的方法,4. 加入重金屬鹽—與蛋白質(zhì)陰離子

17、 (羧基)形成不溶性鹽沉淀5. 超濾法—半透膜濾除可溶性生物大 分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))6. 酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白質(zhì)7. 加熱法—蛋白質(zhì)變性凝固,舉例：常用的去除蛋白質(zhì)的方法,加入與水相混溶的有機(jī)溶劑常用有機(jī)溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃。血樣與溶劑體積比—1：（ 1~3 ） ，可除去90%以上蛋白質(zhì)。高速離心分離（12000r/min ）—離心1~2min，可以將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。注意：普通離心機(jī)（3

18、000r/min）不能將蛋白質(zhì)沉淀完全。,液—液萃取法,原理：大多數(shù)藥物為脂溶性，在有機(jī)溶劑中溶解度大于水中溶解度。大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)。,,溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)—相似相溶的原則沸點(diǎn)低、易揮散，毒性小與水不相混溶不影響進(jìn)一步檢測(cè)具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性,固相萃取法,優(yōu)點(diǎn)：引入雜質(zhì)少完全避免乳化的形成在優(yōu)化條件下有較高的萃取率，重現(xiàn)性也較好可以用較少量的