產(chǎn)微囊藻毒素藻株的PCR檢測方法的研究.pdf

1、水華藍(lán)藻可以產(chǎn)生許多各種不同的毒素（藍(lán)藻毒素），其中發(fā)生最頻繁、危害最大的是一種肝毒素：微囊藻毒素（MC）。淡水中，微囊藻毒素（MC）主要是由微囊藻、魚腥藻和浮絲藻產(chǎn)生的。藍(lán)藻毒素的檢測是研究藍(lán)藻水華的重要方面，快速有效的檢測方法對于判斷湖泊水質(zhì)好壞、建立水華預(yù)警系統(tǒng)、提出合理的治理方法均有重大意義。
　　藍(lán)藻水華發(fā)生時(shí)，有毒藍(lán)藻和無毒藍(lán)藻同時(shí)發(fā)生，不能在常規(guī)的顯微鏡下進(jìn)行區(qū)分?；谖⒛以宥舅睾铣擅富颍╩cy）的分子生物學(xué)方法能

2、夠?qū)撛诘漠a(chǎn)毒藍(lán)藻進(jìn)行檢測。MCs是由微囊藻毒素合成酶基因（mcy）編碼的非核糖體酶復(fù)合物產(chǎn)生的，mcy已經(jīng)在產(chǎn)MC的種類中被標(biāo)記。生物合成基因的存在已經(jīng)被證明是MC產(chǎn)生的先決條件。銅綠微囊藻的mcy基因簇包括嵌入在兩個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄操縱子中的10個(gè)基因：mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ。
　　本文針對微囊藻毒素主要合成酶基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcy

3、E和mcyG基因設(shè)計(jì)了7對檢測引物，其中，針對mcyG基因設(shè)計(jì)了2對引物。同時(shí)針對藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白保守基因序列和微囊藻16srRNA保守基因序列設(shè)計(jì)了兩對對照引物，來對照藍(lán)藻和微囊藻的存在。通過對16種藍(lán)藻的PCR檢測，結(jié)果顯示6種藍(lán)藻基因組對6對檢測引物的PCR反應(yīng)均顯示陽性。通過高效液相色譜（HPLC）檢測相對比，其結(jié)果基本一致。
　　通過優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，成功對mcyA保守基因序列引物和藻藍(lán)蛋白保守基因序列引物兩對引物進(jìn)行雙重

4、 PCR，可以在同一組PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)中看到藻藍(lán)蛋白基因和mcyA保守基因序列的存在。這為以后同時(shí)檢測野外水樣中藍(lán)藻細(xì)胞總量和產(chǎn)微囊藻毒素藍(lán)藻細(xì)胞的總量的定性和定量檢測打下基礎(chǔ)。鑒于產(chǎn)微囊藻毒素微囊藻種類偏多的道理，在雙重PCR的基礎(chǔ)上，加入微囊藻16srRNA保守基因序列引物，對應(yīng)條帶用來指示微囊藻細(xì)胞的含量，成功設(shè)計(jì)三重PCR。
　　為了更簡便的檢測水中微囊藻毒素的存在，采取超聲波破碎的方法對藻液進(jìn)行簡單前處理，進(jìn)行全細(xì)胞PCR