甲胺磷降解菌株的分離鑒定、降解特性及菌株MAP-1的應(yīng)用研究.pdf

1、甲胺磷是一種劇毒有機(jī)磷類殺蟲劑,雖已遭到禁用,但由于其高效、廣譜的殺蟲效果以及低廉的價(jià)格,有些地區(qū)仍在違規(guī)生產(chǎn)和使用。盡管甲胺磷在土壤、水體等環(huán)境中的半衰期較短,但由于甲胺磷的施用量高,甲胺磷帶來的環(huán)境污染和食品安全問題引起了廣泛重視并急需解決。因此,從污染環(huán)境中分離高效、穩(wěn)定的甲胺磷降解菌株,并將其應(yīng)用于甲胺磷等有機(jī)磷農(nóng)藥污染環(huán)境的修復(fù)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本研究從長期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的農(nóng)藥廠下水道污泥中分離獲得三

2、株甲胺磷降解菌株MAP-1、MAP-2和JW-64-1。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,將MAP-1、MAP-2和JW-64-1分別鑒定為生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)和黃色單胞菌科的Luteibacter屬。本研究首次從上述三個(gè)屬中分離獲得甲胺磷降解菌株。
　　 菌株JW-64-1與黃色單胞菌科Luteibacter屬中僅有的三個(gè)模式種L.rh

3、izovicinusDSM16549T、L.yeojuensis DSM17673T及L.anthropi CCUG25036T的16S rRNA基因序列相似性最高,分別為98.6％、98.4％和98.2％,而與其它模式種的同源性均低于97.0％。菌株JW-64-1脂肪酸主要為iso-C17:1ω9c(24.2％)、iso-C15:0(23.0％)和iso-C17:0(20.0％),醌為Q-8,極性酯主要為雙磷酰甘油(DPG)、磷脂酰甘

4、油(PG)、磷氨基脂(PN)、胺脂質(zhì)-1(AL-1)、胺脂質(zhì)-2(AL-2)和磷脂(PL)。JW-64-1的基因組DNA G+C mol％含量為63.7±0.3％。菌株JW-64-1和L.rhizovicinus、L.yeojuensis的DNA-DNA雜交同源性分別為34.8％和25.6％。綜合這些結(jié)果,我們將菌株JW-64-1鑒定為Luteibacter屬中的一個(gè)新種,命名為Luteibacter jiangsuensis sp.n

5、ov.。
　　 菌株MAP-1和MAP-2降解甲胺磷的最適培養(yǎng)基為MSM-3(5 mL CH3OH,1.0 gNH4NO3,1.5 g K2HPO4·H2O,0.5 g KH2PO4,0.5 g NaCl,0.2 g MgSO4·7H2O,水1,000mL,pH7.0-7.2)。菌株JW-64-1降解甲胺磷的最適培養(yǎng)基為MSM-1(1.0 g NH4NO3,1.5 gK2HPO4·H2O,0.5 g KH2PO4,0.5 g N

6、aCl,0.2 g MgSO4·7H2O,水1,000mL,pH7.0—7.2)。菌株MAP-1能利用甲胺磷為唯一碳、氮或磷源生長和降解,完全去除3,000 mg·L-1甲胺磷只需84 h,是已發(fā)現(xiàn)的對(duì)高濃度(>1,000 mg·L-1)甲胺磷降解能力最強(qiáng)的微生物。菌株MAP-2和JW-64-1能利用甲胺磷為碳源生長和降解,96 h以內(nèi)將1000 mg·L-1甲胺磷分別降解69.7％和49.5％。三株菌生長和甲胺磷降解的適溫范圍都為25

7、～30℃,適宜的pH值為6.0～8.0。通氣條件不好對(duì)菌株MAP-2生長和降解甲胺磷的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)菌株MAP-1和JW-64-1的影響。添加1 mmol·L-1Ca2+對(duì)菌株MAP-1、MAP-2和JW-64-1降解甲胺磷有明顯促進(jìn)作用,但菌株MAP-1降解甲胺磷受1 mmol·L-1的Cu2+、Co2+和Ni2+抑制,菌株MAP-2受1 mmol·L-1 Cu2+抑制,菌株JW-64-1受1mmol·L-1Cu2+和Mn2+抑制。添

8、加0.5％蛋白胨或酵母粉對(duì)菌株MAP-1生長和降解甲胺磷具有促進(jìn)作用。和其它兩株菌相比,MAP-1有比較廣的有機(jī)磷農(nóng)藥降解譜,5 d對(duì)500 mg·L-1乙酰甲胺磷、100 mg·L-1水胺硫磷、甲基異柳磷和苯線磷的降解率分別為100％、73.5％、48.3％和32.5％。菌株MAP-2在5 d內(nèi)能完全降解200 mg·L-1乙酰甲胺磷,去除58.4％100 mg·L-1樂果和40.6％100 mg·L-1敵敵畏。菌株JW-64-1降解

9、譜最窄,除甲胺磷外只能降解乙酰甲胺磷,5 d內(nèi)降解85.3％1000 mg·L-1乙酰甲胺磷。
　　 提取了降解菌株MAP-1的粗酶,研究發(fā)現(xiàn)甲胺磷降解酶屬于組成型表達(dá)酶,主要存在于細(xì)胞外膜。菌株MAP-1甲胺磷降解酶最適反應(yīng)pH值7.0、溫度30℃,在總體積5 mL體系中,粗酶液最適添加量80μL、反應(yīng)時(shí)間10 min。Ca2+對(duì)粗酶活性有促進(jìn)作用,Cu2+和Co2+、表面活性劑Triton X-100和SDS、有機(jī)溶劑乙酸乙

10、酯、二氯甲烷和三氯甲烷對(duì)酶活性有顯著抑制作用。
　　 采用MS/MS和GC—MS兩種質(zhì)譜技術(shù)檢測到菌株MAP-1降解甲胺磷存在三種降解產(chǎn)物:單硫代磷酸二甲酯、硫代磷酸單甲酯和磷酸單甲酯,并由這三種降解產(chǎn)物推測出菌株,MAP-1降解甲胺磷的可能途徑。第一步,P-N鍵的斷裂產(chǎn)生單硫代磷酸二甲酯和NH3；第二步,單硫代磷酸二甲酯的P-O鍵被水解釋放CH3O-形成硫代磷酸單甲酯,單硫代磷酸二甲酯也能水解P-S鍵釋放CH3S-形成磷酸單甲

11、酯；第三步,硫代磷酸單甲酯或磷酸單甲酯繼續(xù)發(fā)生P-O鍵或P-S鍵的水解釋放出CH3O-或CH3S-,轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷酸鹽PO43-。
　　 馬肝土中接種107/克干土的降解菌株,9 d內(nèi)可將1,000 mg·kg-1甲胺磷、500 mg·kg-1乙酰甲胺磷降至檢測不出,15d內(nèi)對(duì)100 mg·kg-1水胺硫磷降解率達(dá)40.0％(滅菌土壤)。當(dāng)馬肝土菌株MAP—1接種量加大或向土壤添加甲醇可以促進(jìn)這三種農(nóng)藥的降解。土壤是否處于淹水狀態(tài)

12、不會(huì)顯著影響菌株MAP-1對(duì)土壤有機(jī)磷農(nóng)藥的降解。菌株MAP-1對(duì)土壤中50、10和1 mg·kg-1的甲胺磷、乙酰甲胺磷降解也很顯著,不存在低濃度降解率下降或不降解現(xiàn)象；菌株MAP-1對(duì)土壤中低濃度水胺硫磷的降解效率隨濃度降低提升較快,當(dāng)水胺硫磷濃度為1 mg·kg-1時(shí)降解率達(dá)94.6％。小青菜葉面噴施MAP-1菌液,使用菌數(shù)達(dá)5×1011 cell·m-2,可在7 d的安全間隔期內(nèi)將3倍常規(guī)使用量的甲胺磷、1倍常規(guī)使用量乙酰甲胺磷