凝結芽孢桿菌的篩選及高密度培養(yǎng)工藝研究.pdf

1、本研究從生態(tài)養(yǎng)殖場健康仔豬盲腸及糞便樣品中篩選凝結芽孢桿菌，并對菌株的益生特性及安全性進行研究，最終獲得益生性能良好且無毒、無抗生素抗性的凝結芽孢桿菌BC303；通過階段控制策略實現(xiàn)了該菌體的高密度培養(yǎng)與快速芽孢化，并借助轉錄組測序對BC303芽孢化形成過程的關鍵節(jié)點進行研究，初步構建了BC303的芽孢化起始途徑及相關調控模型。主要研究結果如下：
　　1、從生態(tài)養(yǎng)殖場健康仔豬盲腸及糞便樣品中篩選得到40余株芽孢桿菌，經形態(tài)學、生理

2、生化分析及16S rDNA鑒定，獲得4株凝結芽孢桿菌，分別命名為BC147、BC235、BC310和BC303。四株菌均具有良好粘附能力，并對膽鹽和低酸環(huán)境表現(xiàn)出較強的耐受能力，其中BC303對仔豬腸黏液的黏附率高達41.67％，在pH4的條件下其營養(yǎng)細胞存活率高達91.0％，在0.3％膽鹽中暴露2小時，其存活率仍維持在40％以上。病原菌拮抗試驗發(fā)現(xiàn)，四株菌對常見腸道病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌作用，其中對Salmonella typhim

3、urium ATCC13311高度抑制；同時，四株菌均具有良好的蛋白酶和纖維素酶產生能力，且對不同種類的獸用抗生素均具有不同程度的敏感，其中BC303對所測試抗生素均高度敏感。將BC303作為候選益生菌進行小鼠飼喂試驗，結果表明，該菌株具有良好的安全性，且能提高小鼠的飼料轉化率、免疫能力和日增重。
　　2、以候選益生菌BC303為研究對象，通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化對其發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行研究，最終確定其最佳培養(yǎng)條件為時

4、間20h，初始pH8.0，培養(yǎng)溫度37℃，轉速230rpm，接種量3％；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分最佳配比：葡萄糖15.80g/L，蛋白胨15.90g/L，酵母粉11g/L，MgSO44.60g/L。以8h添加15g/L葡萄糖為最佳補糖方案，可使 BC303的營養(yǎng)細胞密度升高至2.13×1010CFU/mL；在此基礎上，以16h添加1.8g碳酸鈣+1g麩皮+0.1mg異亮氨酸為最佳促孢方案，可使其芽孢量達到1.3×108CFU/mL；對產孢階段的

5、發(fā)酵條件進行研究發(fā)現(xiàn)，40℃、280rpm為其最優(yōu)產孢條件。通過促孢因子的篩選、添加及產孢階段發(fā)酵條件的優(yōu)化，BC303孢子量提高至8.4×108CFU/mL。
　　3、通過原核鏈特異性轉錄組測序對凝結芽孢桿菌BC303芽孢化關鍵節(jié)點進行研究，初步構建了其芽孢化起始通路及相關調控模型。BC303芽孢化可能以組氨酸蛋白激酶KinC、KinE的自我磷酸化為起點，隨后將磷酸傳遞給磷酸傳遞蛋白Spo0F及Spo0B，最終實現(xiàn)產孢轉錄因子S

6、po0A的磷酸化而導致孢子的產生；同時，KinC自我磷酸化后亦可能繞過Spo0F、Spo0B，直接將磷酸基團傳遞給Spo0A使其活化而啟動芽孢化過程，在該過程中Spo0A的活性受菌體密度、DNA損傷、氧化還原狀態(tài)、營養(yǎng)條件及去磷酸化作用等因素的影響。其中Opp、AIP、dnaA、LexA可間接調控組氨酸蛋白激酶的自我磷酸化水平；sda、codY-GTP直接抑制組氨酸蛋白激酶的自我磷酸化；Spo0A-PO4易受到Spo0E的去磷酸化作用。