蛋白質(zhì)化學(xué)下

1、復(fù) 習(xí),1、含有雜環(huán)的亞氨基酸是_____。 脯氨酸2、組成蛋白質(zhì)的氨基酸除____外均含有不對(duì)稱碳原子，所以具有_____。 甘氨酸，旋光性3、異亮氨酸屬于哪一類氨基酸（ ） A 支鏈 B 芳香族 C 雜環(huán) D 堿性A4、下列屬于必需氨基酸的是（ ）A 天冬酰胺 B谷氨酰胺 C酪氨酸 D賴氨酸D,第三章 蛋白質(zhì)化學(xué)（下）,第六節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（重點(diǎn)）,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究?jī)?nèi)容,由哪些氨基酸組成？各種

2、氨基酸的含量？氨基酸之間如何連接？不同氨基酸的排列順序如何？氨基酸長(zhǎng)鏈的空間形狀如何？,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次,一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu),一、一級(jí)結(jié)構(gòu)（序列）,多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，也稱為蛋白質(zhì)的序列或蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 左N右C,什么是序列分析？,根據(jù)完全水解所獲得的氨基酸組成知識(shí)，按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的策略，對(duì)多肽進(jìn)行部分水解、末端測(cè)定、短序列分離和完全水解等，從而得出蛋白質(zhì)多肽鏈的完整的氨基酸

3、序列。,蛋白質(zhì)序列分析的意義,研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系人類血紅蛋白變種有300多種,有些變種嚴(yán)重影響分子的攜氧的能力，進(jìn)行序列分析有助于說(shuō)明血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能差異尋找基因根據(jù)蛋白質(zhì)序列可以反推DNA序列，有助于確定基因和克隆基因,蛋白質(zhì)序列分析原則,1、確定多肽鏈的數(shù)目，肽鏈拆分----獲得單一多肽鏈,多肽鏈的拆分,非共價(jià)交聯(lián)酸、堿、高濃度的鹽、變性劑處理8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍,通過(guò)鏈間二硫鍵交聯(lián)或者存在鏈內(nèi)

4、二硫鍵氧化或者還原二硫鍵使其斷開,1）巰基乙醇法,用過(guò)量巰基乙醇還原二硫鍵使其斷開加入碘乙酸保護(hù)生成的巰基,2）過(guò)甲酸法,加入發(fā)煙甲酸將二硫鍵氧化成磺酸基從而斷開二硫鍵,3）二硫蘇糖醇法,加入二硫蘇糖醇或者二硫赤蘚糖醇還原二硫鍵,,2、蛋白質(zhì)多肽鏈的組成分析---確定每條肽鏈的氨基酸的種類和數(shù)量（需要蛋白質(zhì)完全水解）,蛋白質(zhì)序列分析原則,3、蛋白質(zhì)多肽鏈的末端分析---確定末端氨基酸N末端測(cè)定C末端測(cè)定,蛋白質(zhì)序列分析原則,1）

5、N-末端測(cè)定,DNFB法PITC法DNS法氨肽酶法,DNS法,丹磺酰氯（二甲基氨基萘磺酰氯）6mol/L HCl 105℃水解18hr,氨肽酶法,外切酶，從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序,2）C-末端測(cè)定,肼解法多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物肼化

6、物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離,羧肽酶法,,羧肽酶A作用于促腎上腺皮質(zhì)激素氨基酸的釋放曲線,4、對(duì)多肽鏈進(jìn)行部分水解(酶解)，獲得一套短肽混合物；用不同的酶分別進(jìn)行,得到幾套短肽混合物,蛋白質(zhì)序列分析原則,肽鏈部分水解的方法,化學(xué)法溴化氰法羥胺法酸酶解法（切點(diǎn)多，肽段大小不一）胰蛋白酶,1）溴化氰法,斷開甲硫氨酸羧基參與的肽鍵由于蛋白質(zhì)中含有很少的甲硫氨酸，因此可以得到較大的片斷,2）羥胺法,羥胺能專

7、一地裂解Asn-Gly的肽鍵,5、分離短肽混合物---獲得單一的短肽 6、測(cè)定所有短肽的的氨基酸序列,7、將所獲得的所有序列進(jìn)行拼湊,確定蛋白質(zhì)序列8.測(cè)定二硫鍵位置，測(cè)出全部一級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)序列分析原則,,,二、二級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)多肽鏈自身的折疊和盤繞方式肽鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，不涉及側(cè)鏈維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的力：氫鍵,肽平面,肽平面各個(gè)原子所構(gòu)成的鍵長(zhǎng)、鍵角在蛋白質(zhì)構(gòu)象中恒定不變,二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類,α-螺旋β－折疊β－轉(zhuǎn)角自由

8、回轉(zhuǎn),,,1、α-螺旋,絕大多數(shù)為右手螺旋α-角蛋白：全部由α-螺旋構(gòu)成結(jié)構(gòu)要點(diǎn)每3.6個(gè)氨基酸殘基螺旋上升一圈每圈向上移動(dòng)0.54nm氨基酸殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰螺圈間形成氫鍵，氫鍵基本與中心軸平行SN：3.613,α-螺旋,,完成一個(gè)螺旋需3.6個(gè)氨基酸殘基，螺旋每上升一圈，螺距為0.54nm，相鄰兩個(gè)氨基酸殘基之間的軸心距為0.15nm,l  維持螺旋的作用力是氫鍵，相鄰螺圈之間

9、形成鏈內(nèi)H鍵，H鍵的取向幾乎與軸平行?！?H鍵位置：由每個(gè)殘基的C＝O基與其相 鄰的第四個(gè)殘基的 －NH－的形成H鍵， 所有肽鍵的NH和CO都參與氫鍵的形成， 故α-螺旋很穩(wěn)定。,α-螺旋,2、β－折疊 由兩條或兩條以上幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間氫鍵交聯(lián)而成。肽鏈的主鏈成鋸齒狀折疊構(gòu)象。,要點(diǎn)：l  肽鏈幾乎是完全伸展的，整個(gè)肽鏈成折疊形式。l

10、60; 兩條或多條鏈相互平行，按層排列，相鄰的肽鏈之間形成肽 間的氫鍵，氫鍵由主鏈的-C=O與-NH之間形成氫鍵，所有的肽鍵都參與氫鍵的形成，氫鍵取向與肽鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。l β-折疊兩種類型：平行式：所有肽鏈的N端都在同一端。 反平行式：相鄰的兩條肽鏈方向相反。,β－折疊,β－折疊（平行）,氫鍵傾斜,β－折疊（反平行）,氫鍵垂直，更穩(wěn)定,球狀蛋白質(zhì)中廣泛存在的一種結(jié)構(gòu)肽鏈發(fā)生180度回折，回折角度就是β-轉(zhuǎn)

11、角結(jié)構(gòu)。維持力：由一個(gè)AA殘基的C=O與第四個(gè)AA的殘基的NH之間形成氫鍵。甘氨酸和脯氨酸易于形成β-轉(zhuǎn)角。,3、 β-轉(zhuǎn)角,4 、無(wú)規(guī)卷曲,無(wú)規(guī)卷曲是指多肽鏈主鏈部分形成的無(wú)規(guī)律的卷曲構(gòu)象。,α-螺旋,,,,β-折疊,,,β-轉(zhuǎn)角,,,無(wú)規(guī)卷曲,,,三、超二級(jí)結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)渡態(tài)若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)彼此相互作用，形成有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體；不具有功能；組合方式：??、???、 ???,超二級(jí)結(jié)構(gòu)（ ??轉(zhuǎn)角 ）,,超

12、二級(jí)結(jié)構(gòu)（ ??? ）,,超二級(jí)結(jié)構(gòu)（ ?曲折 ）,,四、結(jié)構(gòu)域,多肽鏈在超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步纏繞折疊形成緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)多結(jié)構(gòu)域的酶分子的活性部位通常分布在結(jié)構(gòu)域之間的“鉸鏈區(qū)”上，有利于結(jié)構(gòu)域發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，與底物結(jié)合,五、三級(jí)結(jié)構(gòu),由于側(cè)鏈基團(tuán)相互作用，多肽鏈進(jìn)一步折疊或者卷曲構(gòu)成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，整個(gè)分子成為球狀或者顆粒狀多肽鏈上所有原子（包括主鏈和殘基側(cè)鏈）在三維空間的分布維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力為疏水作用，其次為氫鍵

13、、離子鍵、范德華力,疏水 相互作用,靜電相互作用,金屬離子配位作用,折疊結(jié)構(gòu)鏈間氫鍵,螺旋結(jié)構(gòu)鏈內(nèi)氫鍵,二硫鍵,側(cè)鏈之間氫鍵,穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力,鯨肌紅蛋白,英國(guó)劍橋大學(xué)的John Kendrew等人 153個(gè)殘基分成8段長(zhǎng)度為7～24個(gè)氨基酸殘基組成的α螺旋區(qū)，各區(qū)之間通過(guò)1～8個(gè)松散的殘基相連內(nèi)部疏水，外部親水,,六、四級(jí)結(jié)構(gòu),分子量大的蛋白質(zhì)由幾條多肽鏈組成，肽鏈間沒有共價(jià)鍵連接，這種肽

14、鏈稱為亞基四級(jí)結(jié)構(gòu)指亞基的相互關(guān)系、空間排布和特定構(gòu)象。維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力主要為疏水作用，其次為氫鍵、離子鍵、范德華力；,馬血紅蛋白,英國(guó)劍橋大學(xué)Max Perutz經(jīng)23年研究于1959年提出,,七、蛋白質(zhì)分子中的化學(xué)鍵,,肽鍵二硫鍵酯鍵離子鍵配位鍵氫鍵范德華力疏水作用,1、肽鍵,肽鍵C-N具有雙鍵的性質(zhì)，不能自由轉(zhuǎn)動(dòng)，因此四個(gè)原子處于同一平面，H和O呈反式排列C=O雙鍵具有單鍵性質(zhì),2、二硫鍵,半胱氨酸穩(wěn)定肽

15、鏈空間結(jié)構(gòu)二硫鍵越多，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越強(qiáng)例如角蛋白不溶于稀堿溶液,3、酯鍵,蘇氨酸、絲氨酸的羥基與磷酸形成磷酸酯與氨基酸的羧基成酯,4、離子鍵（鹽鍵）,具有相反電荷的兩個(gè)基團(tuán)之間的庫(kù)侖作用谷氨酸、天冬氨酸的羧基精氨酸、賴氨酸的氨基高濃度的鹽、過(guò)高或者過(guò)低的pH均可破壞離子鍵，從而使蛋白質(zhì)變性,5、配位鍵,兩個(gè)原子之間形成共價(jià)鍵，共用電子對(duì)由其中一個(gè)原子提供金屬離子和蛋白質(zhì)的連接螯合劑可除去金屬離子導(dǎo)致金屬蛋白變性失活,6

16、、疏水作用,非極性側(cè)鏈（疏水基團(tuán)）在極性溶劑（水）中為了避開水而彼此靠近所產(chǎn)生的一種作用力本質(zhì)為范德華力主要存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,維系一級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力：肽鍵、二硫鍵維系二級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力：氫鍵維系三級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力：疏水作用力維系四級(jí)結(jié)構(gòu)主要作用力：疏水作用力,氫鍵、范德華力、疏水作用力、鹽鍵，均為次級(jí)鍵氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定,小結(jié),,第八節(jié)

17、典型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),一、角蛋白,α-角蛋白毛、發(fā)、羽毛、指甲濕熱和外力拉直 含豐富的胱氨酸，二硫鍵β-角蛋白蜘蛛絲、蠶絲,,二、膠原蛋白,皮膚、軟骨的主要成分各肽鏈為左手螺旋三條肽鏈纏繞為右手大螺旋含有其它蛋白質(zhì)中少見的羥脯氨酸（9％）、羥賴氨酸,三、血紅蛋白,珠蛋白和血紅素 血紅素的第六個(gè)配位鍵在無(wú)氧時(shí)與水分子結(jié)合生成去氧血紅蛋白Hb，在有氧時(shí)則與氧結(jié)合生成氧合血紅蛋白HbO2,,,,第九節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,

18、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸的種類及排列順序）的改變必然影響高級(jí)結(jié)構(gòu)。,1、氨基酸的組成和順序決定了?-螺旋是否存在以及形 成螺旋后的穩(wěn)定程度例如：多聚賴氨酸；多聚谷氨酸2、R基的大小對(duì)多肽鏈能否形成螺旋有影響例如：多聚異丙氨酸；脯氨酸,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（難點(diǎn)）,1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （ 1）一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化 （2）一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病2、蛋白

19、質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （ 1）蛋白質(zhì)變構(gòu)與功能的關(guān)系 （2）蛋白質(zhì)變性與功能的關(guān)系3、蛋白質(zhì)的激活,（1）一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化,同源蛋白質(zhì)的研究：也叫同功能蛋白質(zhì)，有助于研究生物進(jìn)化。 A、同源蛋白質(zhì)的概念： 是指在不同生物體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)。它的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的aa對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱為不變殘基。其他位置的aa差異較大，稱為可變殘基。這種aa順序中的相似性稱為順

20、序同源現(xiàn)象。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,牛、豬、羊、人等在中屬上差異很大，但它們的胰島素在一級(jí)結(jié)構(gòu)上幾乎一致，僅在A鏈的第8，9，10位上的3個(gè)氨基酸有差異。,細(xì)胞色素c是一種廣泛存在于生物體內(nèi)，具有鐵卟啉的色蛋白（含有104個(gè)氨基酸殘基），在生物氧化中起傳遞電子的作用。120個(gè)物種，28個(gè)aa位置不變，是維持構(gòu)象上發(fā)揮功能的必要部位?？勺儦埢S進(jìn)化而變異，親緣關(guān)系越近，aa差異越小。人與黑猩猩大致相同；人與馬有12處不同,B、

21、分子進(jìn)化,（2）一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病,一級(jí)結(jié)構(gòu)相同，功能相同，一級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)小變化導(dǎo)致功能完全不同。A、分子病的概念：由于遺傳基因的突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分 子結(jié)構(gòu)的改變或某種蛋白質(zhì)缺乏引起的疾病。例如：鐮刀性貧血病,舉例：分子病——鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥 1910年發(fā)現(xiàn)于非洲，40年后搞清病因，一種遺傳病。癥狀：紅細(xì)胞在缺氧時(shí)呈鐮刀狀，Hb與O2的親和力改變， 紅細(xì)胞易破裂發(fā)生溶血，運(yùn)氧功能障礙，頭昏、胸悶等貧血癥狀。,病因：血液中血紅

22、蛋白異常（HbS），正常： HbA 血紅蛋白：兩條α鏈和兩條β鏈組成四聚體α2β2 ， α鏈含141AA×2，β鏈含146個(gè)AA×2， 總共574個(gè)AA。,血紅蛋白,HbS與HbA不同：β鏈第6位氨基酸殘基異常。 HbA：第6位氨基酸為Glu。

23、 HbS ：第6位氨基酸為Val。β鏈 HbA (正常) ： H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu---COOH HbS (異常) ： H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu---COOH 除此以外，血紅蛋白的其他部分均完全相同，僅此微小差異（574個(gè)氨基酸中只有兩個(gè)氨基酸差異），使HbA和HbS在功能 上表現(xiàn)出很大

24、的差異。,貧血病人：其血紅蛋白的?-鏈的58、87位， β -鏈的第63、92位上的任何一個(gè)組氨酸被取代，血紅蛋白容易氧化成高鐵血紅蛋白，喪失輸送氧的能力。,說(shuō)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相適應(yīng)性，二者之間有高度統(tǒng)一性。,（3）蛋白質(zhì)的激活,例如：胰島素原的激活,體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，呈無(wú)活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?,蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,以別構(gòu)現(xiàn)象為例別構(gòu)現(xiàn)象：蛋白質(zhì)由

25、于構(gòu)象變化而引起分子性質(zhì)變化從而導(dǎo)致生物功能的變化。,血紅蛋白為例： 血紅蛋白由四個(gè)亞基組成的四聚體，四個(gè)亞基間以次級(jí)鏈相連，每個(gè)亞基含有一個(gè)Fe2+。Fe2+能與氧氣可逆結(jié)合，起運(yùn)輸O2的作用，每個(gè)亞基都結(jié)合一個(gè)O2，每個(gè)Hb最多可結(jié)合4個(gè)O2。,血紅蛋白有兩種構(gòu)象狀態(tài)： T-型構(gòu)象——與氧氣親和力低； R-型構(gòu)象——與氧氣親和力高。 當(dāng)氧氣與Hb中的一個(gè)亞基結(jié)合后引起該亞基構(gòu)

26、象發(fā)生變化，由T → R型構(gòu)象，一個(gè)亞基構(gòu)象的變化又會(huì)引起另外三個(gè)亞基相繼發(fā)生變化，亞基間次級(jí)鍵破壞，使Hb整個(gè)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，使所有亞基都變的適宜與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合的速度大大加快。,變構(gòu)作用：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的一個(gè)亞基結(jié)合氧后，使整個(gè)分子發(fā)生構(gòu)象改變，因而對(duì)氧的親和力急劇增加，這種現(xiàn)象稱為變構(gòu)作用。,,,第十節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)和測(cè)定,一、蛋白質(zhì)的性質(zhì),兩性解離和等電點(diǎn)分子量大，大小不等膠體性質(zhì)沉淀作用變性

27、作用顏色反應(yīng),,二、蛋白質(zhì)的測(cè)定,雙縮脲反應(yīng)福林－酚法考馬斯亮蘭顯色紫外吸收,1、雙縮脲反應(yīng),肽鍵,,,原理,在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫紅色復(fù)合物蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似最大光吸收在540nm，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比測(cè)定范圍：1~10mg蛋白質(zhì)/mL溶液,2、福林－酚法（Lowry法）,在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)—銅復(fù)合物；復(fù)合物將Folin－酚試劑中的磷鉬酸—磷鎢酸還原成藍(lán)色復(fù)合

28、物，藍(lán)色程度與蛋白質(zhì)的含量成正比測(cè)量范圍：25–250μg/mL,3、考馬斯亮蘭比色,1976年由Bradford建立（Bradford法）目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)比色測(cè)定法，最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1?g測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,原理,考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。染料主要是與

29、蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比,4、紫外吸收,蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)嘌呤、嘧啶及核酸等物質(zhì)有干擾,,本章總結(jié)1,蛋白質(zhì)的定義20種常見氨基酸、必需氨基