高級動物生物化學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)-pcr

1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用,周俊宜基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室,DNA,目 錄,PCR技術(shù)簡史 PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用,,PCR技術(shù)簡史,DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,,,PCR技術(shù)簡史,DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,,Kary B. Mullis,>,1989年美國《Science》雜志列PCR 為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mu

2、llis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。,,生物樣品,,DNA片段,基因診斷,基因治療,基因工程產(chǎn)品,法醫(yī)學(xué)檢測,人類學(xué)研究,……,,,,,,基因組DNA,獲取特定DNA片段,,,,,,擴(kuò)增特定DNA片段,,,,,引物,引物,Mullis的構(gòu)思,,,,,DNA聚合酶,DNA聚合酶,,,,特定DNA片段,,94℃,55℃,37℃,,,,,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),,,,酶活性(%),溫度(℃),,,,,,,

3、,,,,,,40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,72℃,,94℃,55℃,,,,,,PCR循環(huán),,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,,,,,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,

4、,,,,,,,,重復(fù)1~3步25~30輪,目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,DNA變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,模板DNA,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,引物1,引物2,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,,PCR的基

5、本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,第1輪結(jié)束,第2輪開始,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,,,,,,,,,,Taq,Taq,Taq,Taq,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,

6、理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù),,,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’

7、端無嚴(yán)格限制。,,,,3’,5’,,3’,5’,,,限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標(biāo)記,,1）PCR反應(yīng)成分,（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。,PCR反應(yīng)條件,（2）引物濃度 0.1-0.5 ?mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特

8、異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。,（4）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+

9、是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,2）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 95oC 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非

10、特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。,（3）延伸 70-75oC， 延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低 錯誤摻入率增加,,PCR的類型和應(yīng)用,研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表

11、達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……,1）不對稱PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,高濃度引物,低濃度引物

12、,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互補引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。,,,,已知序列,未知序列,未知序列,,,,,,,已知序列,未知序列,未知序列,,,限制酶,限制酶,,,,,,,,,連接酶,,3）多重PCR,用于檢測特定

13、基因序列的存在或缺失。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,電泳,引物,,,,,,,,,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分,,,,,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,,,標(biāo)記引物,ＰＣＲ,觀察,PCR產(chǎn)物,5）錨式PCR,,,,已知靶基因

14、片段兩測的序列,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,VH,CH1,CH1,CH2,CH2,CH3,CH3,VH,VL,VL,CL,CL,,,,,,cDNA,,末端核酸轉(zhuǎn)移酶,,3’GG…GG,5’,,CC…CC 錨定引物,,3’GG…GG,5’,CC…CC,,,,,,,,,3’GG…GG,,CC…CC,,6）PCR固相分析法,,,檢測探針信號,7）原位ＰＣＲ,原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR，Is－PCR）是由Haas

15、e等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列,原位PCR的作用 既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)

16、準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。,操作步驟 細(xì)胞或組織的固定 PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段 原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,8）ＲＴ－ＰＣＲ,,,,,,,,逆轉(zhuǎn)錄酶,

17、ＤＮＡ聚合酶,mRNA,cDNA,雜化雙鏈,,PCR擴(kuò)增,,,,,基因,,,,,mRNA,,,蛋白質(zhì)多肽鏈,實時PCR技術(shù)原理,PCR技術(shù)的應(yīng)用,1) 基因克隆,基因工程產(chǎn)品,,,,,,,5’,5’,,,Bam H I,Bam H I,,,,,,,,Bam H I,Bam H I,限制性核酸內(nèi)切酶,2)基因檢測,,A’,內(nèi)源性病變基因,,,正常人,A,病 人,病原微生物基因,,,,正常人 (-),病 人 (+),,遺傳病的診斷

18、,基因缺失、插入或置換等,,,地中海貧血,珠蛋白鏈合成不平衡,,,A,,正常人,病 人,,,,,,,,正常,病人,ASO探針法,,,A,,,C,,,T,G,ASO探針,正常,病人,,,,,,,,,,,,探針雜交,,,NC膜,探針,,,,,,正常人,突變純合子,,,,,,,突變雜合子,PCR-RFLP法：,,,,,限制性內(nèi)切酶,,,,,,,惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）,Ras基因,,,突變,,限制性內(nèi)切酶,,,,,,,正常,突變,電泳,

19、,HLA系統(tǒng)基因分型,,,,PCR-RFLP法,PCR-SSO法,PCR-SSCP,PCR-SSP,3)基因配型,PCR-SSP,,,,,,,,1 2 3 4 5 6 7 8,,,,PCR,,,,1 2 3 4 5 6 7 8,,引物特異性,,,,,,,,,4）基因鑒定

20、,,,,,女性,男性,,,,Y引物,,PCR,,男性 女性,法醫(yī)學(xué)分析,個體識別、親緣鑒定方法：PCR-RFLP DNA遺傳指紋 PCR-ASO PCR-VNTR多態(tài)性 PCR-SSCP 線粒體DNA測序,PCR-VNTR多態(tài)性檢測,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR；電泳檢測,,,,,,父’ 父 子 母,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,現(xiàn) 嫌