與中儲糧交流會

1、2017年4月,2017年度首次交流會,目錄,2,1、手洗法,一、面筋檢測方法討論,步驟：1） 稱量：稱量待測樣品10g，準(zhǔn)確至0.01g，置于100ml燒杯中，記錄為m1。2） 面團制備和靜置：用玻璃棒不停攪動樣品的同時，用移液管一滴一滴的加入4.6ml～5.2ml氯化鈉溶液（2%濃度）。拌合混合物，使其形成球狀面團，注意避免造成樣品損失，同時粘附在器皿璧上或玻璃棒上的殘余面團也應(yīng)收到面團球上。注意：面團樣品制備時間不能超過3min

2、。3）洗滌：將面團放在手掌中心，用容器中的氯化鈉溶液以每分鐘約50ml的流量洗滌8min，同時用另一只手的拇指不停地揉搓面團。將已經(jīng)形成的面筋球繼續(xù)用自來水沖洗、揉捏，直至面筋中的淀粉洗凈為止（洗滌需要2min以上，測定全麥粉面筋時應(yīng)適當(dāng)延長時間）。,一、面筋檢測方法討論,當(dāng)從面筋球上擠出的水無淀粉時表示洗滌完成。注意：前面的操作應(yīng)該在帶篩絹的篩具上進行，防止面團損失。4）排水：將面筋球用一只手的的幾個手指捏住并擠壓3次，以去除在其

3、上的大部分洗滌液。再將面筋球放在潔凈的擠壓板上，用另一塊擠壓板壓擠面筋，排除面筋中的游離水。每壓一次后取下并擦干擠壓板。反復(fù)壓擠直到稍感面筋有粘手或粘板為止（擠壓約15次），也可以采用離心裝置排水，離心機轉(zhuǎn)速為6000r/min±5 r/min，1分鐘。5） 測定濕面筋的質(zhì)量：排水后取出面筋，放在預(yù)先稱重的表面皿或濾紙上稱重，準(zhǔn)確至0.01g，濕面筋質(zhì)量記錄為m2。6） 測試次數(shù)： 同一個樣品左兩次試驗。,2、機洗法,一、

4、面筋檢測方法討論,步驟（全麥粉）：1）調(diào)整面團的混合時間為20s，洗滌時間為5min。2）稱樣及制備面團：稱取兩份10.00±0.01g全麥粉樣品于兩個預(yù)先濕潤的88um的洗滌杯，分別加入2%氯化鈉溶液4.2 ml～5.2ml，將洗滌杯放置儀器固定位置上，啟動儀器，攪拌20s使全麥粉和成面團，然后儀器自動進行洗滌，2min后儀器自動暫停。3）取下洗滌杯，在水龍頭下用冷卻水流小心地把全部已經(jīng)部分洗滌的含有麩皮的面筋，轉(zhuǎn)移到另

5、一個篩孔孔徑為840um粗篩網(wǎng)的酰胺洗滌杯中（建議把兩個洗滌室口對口且細篩網(wǎng)的洗滌室在上，進行轉(zhuǎn)移）。在放回儀器固定位置上，繼續(xù)洗滌3min。大約需用溶液250 ml～280ml。,一、面筋檢測方法討論,4） 離心，稱重：洗滌完成以后，將濕面筋從洗滌室中取出，確保洗滌室中不留有任何濕面筋。將面筋分成大約相等的兩份，輕輕壓在離心機的篩盒上。啟動離心機，離心60s，取下濕面筋，并立即稱重（m1），精確至0.01g。注意：如果離心機有衡重

6、體，可以不必將面筋分成兩份。5）測試次數(shù)：同一份樣品應(yīng)做兩次試驗。步驟（小麥粉）：1）調(diào)整面團的混合時間為20s，洗滌時間為5min。2）稱樣及制備面團：稱取兩份10.00±0.01g小麥粉樣品于兩個預(yù)先濕潤的88um的洗滌杯，分別加入2%氯化鈉溶液4.2 ml～5.2ml，將洗滌杯放置儀器固定位置上，啟動儀器，攪拌20s使小麥粉和成面團，然后儀器自動進行洗滌。,3）儀器自動按50～56ml/min的流量用氯化鈉溶液洗滌

7、5min，自動停機，卸下洗滌杯。大約需用溶液250 ml～280ml。4）離心、稱重同全麥粉,,一、面筋檢測方法討論,,,,,一、面筋檢測方法討論,關(guān)注點：,一、面筋檢測方法討論,,1、方法研究,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,1）放射性免疫分析法在放射性免疫分析中，最早也是最常使用的標(biāo)記物是I125，它標(biāo)記抗體或抗原的方法有兩種，第一種是標(biāo)記具有酪氨酸側(cè)基的蛋白質(zhì)。在氯胺T 或乳糖過氧化酶-H2O2 存在下，NaI125 和蛋白質(zhì)的酪氨

8、酸側(cè)基反應(yīng)， I125 置換芳香環(huán)上的氫，形成安定的標(biāo)記化合物，反應(yīng)式如圖 1 所示。,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,優(yōu)點：（1）很高的檢測靈敏度，可達 10-17mol/L。 （2）因為很少受到干擾，所以信號穩(wěn)定。 （3）放射性標(biāo)記物體積小，受空間位阻影響小，生物活性受影響小。缺點：（1）放射能的危險性：由于放射性污染的危險性。因而其輸送、儲藏、使用均有嚴格的法律限制，同時放射性廢棄物的處理更

9、是麻煩。 （2）放射性同位素的不穩(wěn)定性：這是放射性免疫分析法的最大缺點。I125 的半衰期只有 59.4 天，因而其標(biāo)記蛋白質(zhì)實際的儲存壽命只有數(shù)周至二個月。無論使用多么穩(wěn)定的放射性同位素進行標(biāo)記，也必須每天測定工作曲線且一段時間后必須重新標(biāo)記。 （3）放射性測定前，游離型標(biāo)記蛋白質(zhì)必須除去，不利于實現(xiàn)自動化。,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,2）酶標(biāo)記免疫分析法 因為在檢測中不需要引進發(fā)

10、出信號的化合物，只是在反應(yīng)后生成可發(fā)出檢測信號的物質(zhì)。使它成為一種取代放射性免疫分析的一種分析工具。它的原理是無信號的基質(zhì)在酶的催化作用下發(fā)生顯色（或發(fā)光）反應(yīng)，其生成物的濃度正比于酶的濃度。通過測量生成物的濃度，即得到酶標(biāo)記蛋白質(zhì)的濃度。,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,這些標(biāo)記物標(biāo)識蛋白質(zhì)的方法主要是采用架橋試劑，如下圖所示幾種。,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,從整體上來說使用該法進行測定時酶的活性及其被標(biāo)記物的活性極易受標(biāo)記反應(yīng)的影響，同時

11、酶的活性極易受溫度、pH、及溶液中的離子濃度（Zn2+、Mg2+、N3-）等的影響，所以測定的靈敏度及精密度大部分情況下不如放射性免疫分析法。,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,3）化學(xué)發(fā)光免疫分析法化學(xué)發(fā)光分析法與熒光分析法之間的主要區(qū)別在于熒光需要激發(fā)光，而化學(xué)發(fā)光不需要激發(fā)光。應(yīng)用的化合物主要有：氮蒽類衍生物，蟲熒光素及與之相對應(yīng)的熒光素酶，環(huán)芳基酰肼，穩(wěn)定的二乙氧烷和草酸衍生物。其發(fā)光原理以氮蒽類衍生物為例說明，如下圖 所示。,二、嘔

12、吐毒素檢驗方法討論,化學(xué)發(fā)光免疫分析法，特別是使用 Acridinium 衍生物作為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光免疫分析法與酶免疫分析法相比具有更高的靈敏度。但化學(xué)發(fā)光也存在一定的缺點。尤其是它的發(fā)光不穩(wěn)定，容易受外界環(huán)境的影響，例如 pH 和溫度。當(dāng)溶液的 pH 改變時，不但發(fā)光量子收率降低，而且光譜最大波長也可能發(fā)生變化位移。,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,4）熒光免疫分析法 熒光化合物在熒光標(biāo)記，高效液相色譜柱前及柱后衍生化、DNA 分

13、析、流動細胞計數(shù)和免疫分析中都有廣泛的應(yīng)用。比較重要的熒光化合物有熒光素和羅丹明及它們的衍生。熒光素和羅丹明衍生物具有較高的熒光量子產(chǎn)率和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但它門在免疫分析中的靈敏度只有 10-10M 左右， 這主要是受以下幾方面的限制： （1）背景熒光干擾大。生物分子在 350 ～600 nm 多有強熒光信號，與常規(guī)熒光化合物的發(fā)射光譜相互重疊。導(dǎo)致方法靈敏度劇烈下降，另外許多多相測定材料都有一定的背景值。,二、嘔吐毒素檢驗方法討

14、論,（2）光散射的干擾。來源于儀器和樣品（包括 Tyndall，Rayleigh，Raman現(xiàn)象）的雜散光嚴重影響測定結(jié)果。 （3）淬滅現(xiàn)象。外界環(huán)境的變化，例如 pH，極性，含氧水平和與其它重原子或吸收基團靠近等等，都會引起熒光強度的變化。 （4）Stoke 位移小。一般熒光化合物的 Stoke 位移約為 24～50nm。這使散亂光及固相材料的影響更加嚴,2、主要方法對比,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,1）快檢卡—膠體金免

15、疫層析法,膠體金法檢測原理,操作簡便、快速,可實現(xiàn)現(xiàn)場篩查,靈敏度較低，其無法給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果,均一性較差，易出現(xiàn)假陽性和假陰性,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,1）快檢卡—熒光定量法,熒光定量法檢測原理,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,1）快檢卡——熒光定量法,熒光定量法檢測原理,操作簡便、快速,可實現(xiàn)現(xiàn)場篩查,靈敏度略低，均一性略差,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,2）酶聯(lián)免疫分析方法,酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測原理,靈敏度較高、線性范圍較寬,結(jié)

16、果相對比較準(zhǔn)確，能給出定量結(jié)果,操作相對繁瑣，檢測時間較長,實驗結(jié)果的重復(fù)性與操作人員的熟練程度密切相關(guān),一次檢測樣本量要求比較多，不能隨到隨檢,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,4）不同方法學(xué)性能對比,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,5）工廠檢驗方法介紹——酶聯(lián)免疫法,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,1、樣品制備 粉碎并取5.0g有代表性的樣本置入100mL具塞三角瓶中，加入25mL去離子水與其混合；于振蕩器上劇烈振蕩10分鐘，轉(zhuǎn)速為150

17、r/min；取液體于4000r/min離心5min(或靜置3min，再用定量濾紙過濾)；取上清或濾液1mL，再加入4mL去離子水，振蕩5S或手搖勻, 取50μL進行分析。2、檢測步驟： 1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20~25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL/孔到對應(yīng)的微孔中，再加入嘔吐毒素酶標(biāo)物50μL/孔，最后加入嘔吐毒素抗試劑5

18、0μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。,5）工廠檢驗方法介紹——酶聯(lián)免疫法,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,3、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。 4、顯色：加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境反應(yīng)15mi

19、n。 5、測定：加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。,5）工廠檢驗方法介紹——HPLC,二、嘔吐毒素檢驗方法討論,1、樣品制備 準(zhǔn)確稱取5.0g粉碎的樣品，加入5g聚乙二醇8000，并與25mL水混合，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min或振蕩提取30min，用快速定性濾紙過濾， 并用玻璃微纖維濾紙過濾，至濾液

20、澄清，備用。2、親和柱凈化 3mL柱管去掉上方塞子，安裝上轉(zhuǎn)接頭，將轉(zhuǎn)接頭另一端與20mL針筒固定后使用；將1mL柱管上方堵頭取出后斜剪斷，再插回柱子上。 準(zhǔn)確移取上述濾液，注入針筒中，調(diào)節(jié)針筒壓力使其以1滴/2秒的速度緩慢通過免疫親和柱；用20mL 水沖洗柱子，流速1滴/秒，棄去流出液，直至2~3mL空氣過柱體，保證柱子內(nèi)沒有殘余液體； 準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫，流速自然重力，直至2~3mL空氣通過柱體，保