細胞融合與紅細胞膜滲透性觀察

1、細胞融合與紅細胞膜滲透性觀察,一、實驗原理,細胞融合（cell fusion）又稱細胞雜交（cell hybridization），是指兩個或兩個以上的細胞融合成一個細胞的現(xiàn)象。細胞融合術(shù)是細胞遺傳學(xué)、細胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆細胞株的重要技術(shù)。,在誘導(dǎo)物（如仙臺病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的細胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩質(zhì)膜，形成雙

2、核或多核細胞。,細胞融合,病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動物細胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙臺病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。優(yōu)點：融合率較高，對各種動物細胞都適宜，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；缺點：仙臺病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞后，可能會對細胞的生命活動產(chǎn)生干擾

3、。,病毒誘導(dǎo)融合,在不同種類的動物細胞混合液中加入聚乙二醇，就會發(fā)生細胞凝集作用；聚乙二醇誘導(dǎo)細胞融合的機理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方便，誘導(dǎo)細胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對有些細胞(如卵細胞)不適用。,聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合,20世紀(jì)80年代建立起來的電融合技術(shù)，是將兩種細胞的混合液置于低壓交流電場中，使細胞聚集成串珠狀，然后施加高壓電脈沖，以促使細胞融合。緊密排列的細胞，當(dāng)受到電擊時，細胞部分區(qū)域就

4、會被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細胞之間的細胞質(zhì)連通，進而發(fā)生細胞融合。電融合技術(shù)有許多優(yōu)點，如誘導(dǎo)細胞融合的頻率高，對細胞無毒害作用，操作簡便，可重復(fù)性好。,電融合,電融合儀,1. 器具: 顯微鏡 離心機 天平 離心管 細滴管 載片、蓋片2. 試劑: 50%聚乙二醇(PEG)：稱取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至50℃時，加入等體積并預(yù)熱至50℃的GKN液混勻。Alsver液：葡萄糖2

5、.05g 檸檬酸鈉0.8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000ml重蒸水中。0.85%NaCl液,二、實驗器材與試劑,,1.用注射器取2ml Alsver液，再從翼下靜脈取鴨血2ml，注入管內(nèi)，再加6ml Alsver液，混勻后置4℃冰箱中可備作3-4用。2

6、. 實驗時取“1”液1ml于離心管中，加入4ml 0.85%的NaCl液，混勻平衡后以1200rpm離心5min。3. 去上清液。再重復(fù)“2”兩次，最后一次離心10min。4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混勻使之成為細胞懸液。5. 在“4”液中加入6—8滴（約0.5ml）50%的PEG液，迅速混勻，常溫下2-3min滴片鏡檢。,三、實驗內(nèi)容及方法,四、結(jié)果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的鴨血細胞膜融

7、合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的鴨血細胞。五、融合率的計算 在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。,作業(yè)：描述顯微鏡下細胞融合的變化，計算融合率。,細胞膜是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選擇性地讓某些物質(zhì)進出細胞。而對于不同性質(zhì)的物質(zhì)，細胞膜的通透性有所不同。當(dāng)

8、細胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴散，以至于在高滲環(huán)境中，細胞會失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細胞會吸水膨脹直至破裂。,一、實驗原理,紅細胞膜滲透性觀察,兔紅細胞滲透壓的觀察1.取一小燒杯，用肝素液（1mg/ml生理鹽水）濕潤， 然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋，制成兔血細 胞懸浮液.2.取5支試管，編碼后依次向各試管加入1.5%NaCl液 5,3,2,1,0 ml,然后分