認(rèn)知侵襲性真菌感染的實驗室診斷_第1頁
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文檔簡介

1、認(rèn)知侵襲性真菌感染的實驗室診斷,匯報人 楊燁建,何為侵襲性真菌感染?,DFI(deep fungal infection),真菌侵犯毛發(fā)、表皮、甲床以外的組織(皮下組織、黏膜、肌肉、內(nèi)臟器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等)引起的感染。,DFI中急、危、重者。真菌在組織器官或血液中生長繁殖,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織器官損傷,常伴多器官功能障礙。,IFI(invasive fungal infection),2007年歐洲癌癥治療研究組織(EORTC)侵襲性

2、真菌感染協(xié)作組(IFICG)和美國國立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所霉菌病研究組(NIAID-MSG)將IFI改稱IFD。國內(nèi)未獲響應(yīng),現(xiàn)僅用于侵襲性念珠菌病(invasive candidosis,IC)和曲霉病(invasive aspergillosis,IA)。,IFD(invasive fungal disease),IFI診斷依據(jù),EORTC和NIAID/MSG 2007年修訂標(biāo)準(zhǔn),國內(nèi)各學(xué)會診治指南。IFI診斷分級: 擬診(po

3、ssible) 臨床診斷(probable) 確診(proven),IFI診斷依據(jù),IFI分級診斷標(biāo)準(zhǔn),(1)血液真菌培養(yǎng)陽性,但曲霉、青霉(馬爾尼菲青霉除外)需排除污染。(2)導(dǎo)管相關(guān)性真菌血癥,導(dǎo)管培養(yǎng)與血培養(yǎng)均陽性,且為同一真菌。(3)胸水真菌培養(yǎng)陽性。(4)肺組織真菌培養(yǎng)陽性。(5)合格痰標(biāo)本或BALF鏡檢發(fā)現(xiàn)肺孢子菌包囊、滋養(yǎng)體或囊內(nèi)小體。(6)胸水、CSF、血液直接鏡檢發(fā)現(xiàn)新生隱球菌。(7)直接導(dǎo)尿培養(yǎng)念珠菌

4、>105CFU/ml。,有確診價值的微生物學(xué)檢查,常見IFI病原的診斷,以下列念珠菌屬最常見: 白色—(C.albicans)、光滑—(C.glabrata)、 熱帶—(C.tropicalis)、近平滑—(C.parapsilosis)、克柔—(C.krusei)、都柏林—(C.dubliniensis)、季也蒙—(C.guilliermondii)。 北京大學(xué)人民醫(yī)院血液科(2004.4~2005.2間)165株念

5、珠菌,其中: 白念78.8%,其他念珠菌21.2%; 張紅金等2006.1~6月ICU患者并發(fā)IFI 137例,其中: 白念65株(47.4%)、光滑36株(26.3%)、熱帶28株(20.4%)、平滑5株(3.6%)、克柔2株(1.5%)、青霉1株(0.7%)。,常見IFI病原(1)念珠菌屬(Candida),單因素分析: 念珠菌定植、WBC<0.5×109/L持續(xù)>10d、使用碳青霉烯類抗生素是

6、惡性血液病患者發(fā)生IC的危險因素;多因素分析: WBC<0.5×109/L持續(xù)>10d是IC唯一危險因素。,IC發(fā)病的重要前提是念珠菌定植,(1)革蘭染色、乳酸酚棉藍(lán)染色,鏡檢4~6μm圓或卵圓芽胞,可見出芽,假菌絲。 ?用含熒光增白劑(Calcofluor White ,CFW)的10%~20% KOH涂片,紫外線激發(fā)呈藍(lán)白或綠色熒光。(2) 培養(yǎng)于沙氏培養(yǎng)基生長乳白色酵母樣菌落; ?玉米粉-Tw

7、een80瓊脂生長假菌絲、厚壁孢子; ? CHROMagar培基上(35℃)菌落呈色:白念-綠色,熱帶-藍(lán)灰,粉紅、邊緣模糊-克柔。 ?其他種為白色至粉紅色。血清(雞蛋清)中37℃ 2~3h白念產(chǎn)生芽管。 ?種間鑒別用糖發(fā)酵和糖同化試驗。,常規(guī)檢查,(1)測抗原 胞壁1,3-β-D-葡聚糖(G試驗),表面抗原甘露聚糖(LA試驗),熱不穩(wěn)定蛋白(LA試驗),胞漿蛋白烯醇化酶(ELISA和WB),Mr

8、65000蛋白(抑制ELISA)等。(2)測抗體 烯醇化酶(P47)抗體(ELISA),白念珠菌芽管抗體(CAGTA)間接免疫熒光法。,血清學(xué)試驗,(1)以ITSI(internal transcribed spacer 1,內(nèi)部可轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1)為靶基因的泛真菌PCR加DNA測序法(可測念珠菌、隱球菌、曲霉、鐮刀菌等多種真菌)。(2)泛曲霉念珠菌檢測法(pan-AC assay)用種特異探計real-timePCR(常見的6種

9、念珠菌、9種曲霉)。(3)以28SrDNA為靶基因的real-timePCR??蓽y念珠菌、曲霉、隱球菌、毛霉、青霉等。(4)多串連PCR(multiplex tandem PCR,MT-PCR)以ITS1、ITS2、EF1-α、β微管蛋白(β-tubulin)為靶基因,可測常見念珠菌、隱球菌、曲霉、鐮刀菌、接合菌等。(5)反向線點雜交(reverse line blot hybridization,RLB)和基因芯片(oligon

10、ucleotide microarray)技術(shù)。尚未獲批準(zhǔn)。,分子生物學(xué)診斷,185個種中有20多個可致機(jī)會性感染 常見為: 煙曲霉(A.fumigatus)、黃曲霉(A.flavus)、黑曲霉(A.niger)。 棒曲霉(A.clavatus)、灰綠曲霉(A.glaucus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)、焦曲霉(A.ustus)、雜色曲霉(A.versicolor)

11、也有報告。,常見IFI病原(2)曲霉菌屬(Aspergillus),曲霉菌孢子是鏈狀的,成熟后脫落,2~5μm,易在空氣中懸浮。經(jīng)空氣吸入孢子致病,與定植無關(guān)。,曲霉鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征,血清學(xué)試驗:G試驗,GM試驗。 分子生物學(xué)診斷:同念珠菌屬。,包括: 菌落顏色,分生孢子梗形態(tài)、顏色,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)數(shù)目,頂囊形態(tài)等。 煙曲霉耐高溫,40℃(38.5~50℃)生長良好。,約78個種,致病的約17個種和8個變種,引起IFI的主要

12、為: --- 新生隱球菌(C.neoformans), --- 有新生變種(var.neoformans)(血清型D型), --- 格特變種(var.gatii)(B、C型), --- grubii變種(var.grubii)(A型)。在A、B、C、D、AD血清型中,我國已見A、D及AD型,A型最多。,常見IFI病原(3)隱球菌屬(Cryptococcus),感

13、染途徑:經(jīng)呼吸道吸入孢子(可從鴿糞、按樹分離),侵犯肺與神經(jīng)系統(tǒng)。鑒定要點:沙氏培養(yǎng)基25℃~37℃均生長。CSF直接或離心沉淀物涂片墨汁染色發(fā)現(xiàn)圓或橢圓雙層厚壁孢子,外有寬莢膜。菌體可見單個出芽。,血清學(xué)試驗: 隱球菌莢菌多糖抗原膠乳凝集試驗(LA),試劑盒法國PaxtorexTM Crypto Plus,紅色膠乳顆粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)單抗。 標(biāo)本:血清、CSF、BALF、尿,血清和CSF用鏈霉蛋白酶56℃

14、、30min預(yù)處理。 假陽性:RF>500IU/ml時(9/26);TB患者血清(2/26)。1:4稀釋轉(zhuǎn)陰。ELISA法: 多抗包被,酶標(biāo)記單抗檢測。不受RF干擾。分子生物學(xué)診斷: 同念珠菌屬。,,組織病理中的隱球菌(PAS),墨汁染色中的隱球菌,隱球菌性腦膜炎診斷,腦脊液檢查墨汁涂片培養(yǎng)動物接種電鏡觀察莢膜抗原乳膠凝集試驗(LAT)分子生物學(xué)的方法涂片和培養(yǎng)對于診斷具有決定意義,直接墨汁涂片,陽性率大約

15、為60%優(yōu)點:快速簡便、可做菌體計數(shù)當(dāng)腦脊液中的菌體數(shù)較少 (低于103/mm3 )常常會有假陰性結(jié)果,需要做進(jìn)一步的檢查,真菌培養(yǎng),對本病的診斷有決定意義,是確診的金標(biāo)準(zhǔn)診斷的敏感性高于直接真菌涂片腦脊液真菌培養(yǎng)的方法,對于培養(yǎng)的結(jié)果具有重要的影響,莢膜抗原乳膠凝集實驗(LAT),LAT是以高效價的抗隱球菌莢膜多糖抗體吸附于標(biāo)準(zhǔn)大小的乳膠上,檢測血清或CSF標(biāo)本中的隱球菌莢膜抗原。特異性接近100%,敏感性約為95%與菌

16、體計數(shù)具有平行性,對于預(yù)后判斷有幫助,屬真菌界,子囊菌門,古子囊菌綱,肺孢子菌目,肺孢子菌科,肺孢子菌屬。1909年Chagas首先發(fā)現(xiàn)(克氏錐蟲),至上世紀(jì)80年代一直歸為原蟲(真菌培養(yǎng)基不生長;細(xì)胞膜無麥角固醇,對麥角醇合成抑制劑類抗真菌藥耐藥,但對抗原蟲藥敏感)。,常見IFI病原(4)卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii),直接鏡檢: 痰(30%)、BALF(75%)、經(jīng)皮穿刺肺活檢(60%)、開胸

17、肺活檢(95%)查找包囊等。染色法:Gomori’s環(huán)六亞甲基四胺銀(GMS),亞甲胺藍(lán)、熒光素染色(染包囊壁和囊壁括弧樣結(jié)構(gòu))。培養(yǎng): Uero、CEI、WI-38、MRC-5和Chang肝細(xì)胞等。,血清學(xué)試驗: 查抗原:熒光素標(biāo)記單抗測標(biāo)本中包囊、滋養(yǎng)體,陽性率97%~99%。 查抗體:ELISA、IIF、WB查抗體,陽性率50%~ 90%,假陽性率高。WB法測抗Mr 35000~45000抗體,提示活動感染。

18、分子生物學(xué)診斷: 同念珠菌屬。,無性型在孢子囊內(nèi)形成不能游動的靜孢子,有性型形成接合孢子。毛霉目(Mucorales)、蟲霉目(Entomophthorales)中部分種可致毛霉病(mucormycosis)或接合菌?。▃ygomycosis)。,常見IFI病原(5)接合菌(Zygomycetes),毛霉屬(Mucor)、根霉屬(Rhizopus)、犁頭霉屬(Absidia)、根毛霉屬(Mucor Rhizomucor)、被

19、孢霉屬(Mortierella)、共頭霉屬(Sycephalastrum)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、瓶霉屬(Saksenaea)等致病的種多。吸入孢子、創(chuàng)傷感染、食入污染食物致病。特點是菌絲侵犯血管,引起栓塞、組織壞死、化膿性反應(yīng)和肉芽腫。最常播散至腦,鼻竇炎、眶窩織炎、肺炎。鼻腦毛霉病占30%~50%,病死率80%~90%,次為肺、胃、腸毛霉病。,毛霉目中有7個科、12屬、24種致病,直接鏡檢標(biāo)本中見90&

20、#176;角分支的寬大、透明、無分隔或極少分隔菌絲可診斷。確診須從組織切片中找到菌絲。蟲霉目中1科、2屬、3種致?。?蛙糞霉屬(Basidiobolus)中的固孢蛙糞霉(B.haptasporus),耳霉屬(Conidiobolus)中的冠狀耳霉(C.coronatus)和異孢耳霉(C.incongruus)。傳入途徑: 微小外傷,昆蟲叮咬。,直接鏡檢標(biāo)本中寬大、不規(guī)則,無分隔的薄壁真菌菌絲及其片段。分子生物學(xué)診斷:同念珠菌

21、屬。,25℃菌絲相、37℃酵母相的致病真菌包括申克孢子絲菌,馬爾尼菲青霉、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌等。有的有地域分布特點;對人致病力強(qiáng),感染無須免疫受損。,常見IFI病原(6)雙相型真菌,申克氏孢子絲菌鏡下特征,纖細(xì)分支分隔菌絲直角分枝的分生孢子梗,頂端梨形或圓形小分生孢子,呈“梅花瓣樣”結(jié)構(gòu)有的小分生孢子沿菌絲兩側(cè)排列,呈“袖套狀” 酵母相鏡下可見革蘭陽性卵圓形或梭形孢子,,,自然界土壤、竹筍

22、、甘蔗中(25℃)多以菌絲形式存在,組織中形成酵母樣細(xì)胞,兩端鈍圓,有橫隔。竹鼠為帶菌動物。吸入本菌孢子或食入霉變甘蔗發(fā)病。侵犯單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng),全身重要臟器均可受累。所致IFI 70%見于AIDS患者。,馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei),骨髓、外周血涂片,皮膚、淋巴結(jié)活檢組織涂(切)片,潰瘍分泌物涂片,巨噬細(xì)胞內(nèi)外直徑2~3μm,有1~3個橫隔的橢圓(臘腸)形細(xì)胞。糖原染色可與黑熱病LD小體和莢膜組織胞漿

23、菌鑒別。培養(yǎng)陽性為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。陽性率骨髓100%,皮損90%,血液76%。血清學(xué)試驗檢測Mp1基因編碼的本菌特異的胞壁甘露糖蛋白Mp1P抗原或其特異抗體。分子生物學(xué)診斷:同念珠菌飛行屬。,馬爾尼菲青霉鑒定依據(jù),雙相菌直接或病理檢查找到臘腸形孢子 菌落特征(培養(yǎng)基被染成紅色)和鏡下結(jié)構(gòu)(帚狀枝及孢間連體)在察氏培養(yǎng)基上生長不良(麥芽汁培養(yǎng)基上生長良好),菌絲相,酵母相,菌絲相(正面),菌絲相(反面),馬爾尼菲青霉,臘腸形孢子,

24、某些種與大骨節(jié)病、克山病、食管癌有關(guān),在真菌性角膜炎中占58.7%??芍滦摹⒛X、肺感染和真菌血癥。引起的IFI逐年增多,發(fā)病率、死亡率僅次于白念珠菌和曲霉所致感染。吸入本菌致肺感染,類似IA。侵犯血管引起血栓致組織壞死。,常見IFI病原(7)鐮刀菌屬(Fusarium),特征:典型鐮刀形大分生孢子,大、小不等,有2~5個分隔。但即使多次分離出同一真菌也只能是疑診。確診:培養(yǎng)陽性,病理組織切片發(fā)現(xiàn)本菌。,介紹兩個實驗,GM試驗

25、 G試驗,GM試驗 檢測曲霉半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)抗原。 試劑盒:Bio-Rad公司 PLATELIATM Aspergillus EIA. 原理: 一步酶免疫夾心微孔板法……,(1)GM連續(xù)2次陽性 有臨床診斷價值。(2)GM陰性不能排除IA(GM低于可測限);高?;颊邞?yīng)每周2次篩查。(3)A值<0.000提示操作、試劑、儀器有誤,應(yīng)復(fù)測。(4)假陰性:見于慢性肉芽腫病,Job

26、’s綜合征及某些用抗真菌藥治療的IA患者。,結(jié)果解釋:,(5)假陽性: ①青霉屬(Penicillium)、交鏈孢屬(Alternaria)、擬青霉屬(Percilomyces)、地絲菌屬(Geotrichum),組織胞漿菌屬(Histoplasma)真菌與EBA-2單抗有交叉反應(yīng)。 ②某些谷類制品、乳脂點心中含半乳呋喃糖(galactofuranose),牛奶制品(humanized milks)含高濃度GM

27、,常在嬰兒造成GM假陽性。 ③某些批次半合成β內(nèi)酰胺抗生素(piperacillin/tazobactam,amoxicillin與clavulanic acid)中含GM抗原。(6)GM試驗對中性粒細(xì)胞減少癥IA患者診斷價值較高,對非中性粒細(xì)胞減少的IA診斷價值較差。,G試驗: 檢測真菌(念珠菌、曲霉、肺孢子菌等)壁1,3-β-D葡聚糖(glucan). 適用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮孢霉等引起的感染。 試劑盒

28、: Glucatell (美國Cape Code公司), 2003年美國FDA批準(zhǔn), 美洲鱟: 界值60pg/ml。 Fungitec.G(日本Seikagaku Kogyo公司),東方鱟: 界值20pg/ml。 Goldstream(北京金山川公司): 界值20pg/ml。,試驗原理 類似檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試驗(limulus lysate test),細(xì)菌內(nèi)毒素/1,3-β-D-glucan激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的凝

29、固酶原,生成凝固蛋白,引起濁度/色度變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢樣中1,3-β-D-glucan含量。,參考值 20pg/ml IFI(不能區(qū)分真菌種屬) ? 以≥50pg/ml為陽性, 診斷IFI敏感性63.6%, 特異性90.8%. ? Cut off值, 敏感性, 特異性尚待大規(guī)模臨床驗證。,1、真菌感染檢查知識普及,人才培訓(xùn)。2、質(zhì)優(yōu)價廉的商品試劑盒供應(yīng)。3、產(chǎn)、學(xué)、研結(jié)合,研發(fā)驗證新方法、新試劑。,幾點

30、建議,IC和IA的相關(guān)血清學(xué)研究,分離提取白念珠菌烯醇化酶基因工程制備白念珠菌烯醇化酶動物模型考察侵襲性白念珠菌感染后抗體產(chǎn)生規(guī)律制備烯醇化酶單克隆和多克隆抗體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選煙曲霉優(yōu)勢抗原巢式PCR技術(shù)檢測煙曲霉DNA用煙曲霉分泌蛋白檢測侵襲性曲霉病人以及疾病模型動物抗體,評估診斷價值。,展望,血清學(xué)方法有益于IC的早期診斷;目前市場提供診斷試劑品種少,檢測的敏感性、特異性尚不能滿足需要;解決IC早期快速診斷問題任重

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