UV-H2O2對(duì)銅綠微囊藻抑制特性及其對(duì)微囊藻毒素降解機(jī)理研究.pdf

1、水體富營(yíng)養(yǎng)化及其引發(fā)的有害藻類水華是我國(guó)當(dāng)前主要面臨的環(huán)境問(wèn)題之一。有關(guān)有害藻類污染治理的方法和技術(shù)的研究一直以來(lái)是水污染控制領(lǐng)域的熱點(diǎn)。在UV/H2O2光氧化體系中，H2O2光解產(chǎn)生強(qiáng)氧化劑·OH，其具有高效殺滅微生物、快速降解有機(jī)化合物的特點(diǎn)，因而UV/H2O2在有害水華藻類防治領(lǐng)域的運(yùn)用潛力巨大。本論文系統(tǒng)地研究了UV/H2O2對(duì)水華銅綠微囊藻抑活機(jī)理及效應(yīng)、UV/H2O2處理后藻胞內(nèi)/外毒素變化、UV/H2O2對(duì)微囊藻毒素的降解

2、動(dòng)力學(xué)和降解機(jī)理。
　　 本論文的主要研究如下：
　　 1.UV/H2O2抑藻機(jī)理及抑藻效應(yīng)研究
　　 建立了水楊酸捕獲法測(cè)定·OH的HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相為20％甲醇+80％水(含0.03 M乙酸和0.03 M檸檬酸)，流速為1mL/mim同時(shí)證實(shí)了UV/H2O2體系中生成的·OH參與了藻細(xì)胞的氧化損傷過(guò)程?；谠寮?xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平和生理生化指標(biāo)分析得出結(jié)論，UV/H2O2對(duì)藻細(xì)胞的損傷機(jī)理主要是通過(guò)·OH氧化

3、損傷藻細(xì)胞膜，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而損傷藻細(xì)胞DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子和光合作用系統(tǒng)。藻毒素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量受到UV/H2O2處理的抑制，因而UV/H2O2抑制藻生長(zhǎng)的同時(shí)可抑制胞內(nèi)毒素的合成量，從而減少釋放至水體的毒素含量。
　　 本論文同時(shí)研究了銅綠微囊藻分別經(jīng)UV254、H2O2及UV/H2O2處理后繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)情況，研究結(jié)果表明：H2O2和UV254對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制效應(yīng)均隨作用劑量的增加而增強(qiáng)

4、；UV/H2O2對(duì)銅綠微囊藻的抑制存在明顯的協(xié)同效應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)室條件下，0.2 mM H2O2結(jié)合38 mJ/cm2 UV254輻照劑量是抑藻效應(yīng)最強(qiáng)的組合；結(jié)合掃描電鏡分析表明，UV/H2O2處理對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)造成破壞。藻液經(jīng)0.2 mM H2O2結(jié)合38 mJ/cm2 UV254輻照劑量聯(lián)合處理后第10d，幾乎所有藻細(xì)胞凹陷變形，很多藻細(xì)胞細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞質(zhì)外溢而死亡。
　　 2.UV/H2O2抑藻過(guò)程中銅綠微囊藻胞

5、內(nèi)/外毒素變化研究
　　 本論文結(jié)合HPLC和ESI-MS/MS技術(shù)對(duì)銅綠微囊藻905胞內(nèi)毒素鑒定結(jié)果表明，胞內(nèi)毒素除MCLR以外，還存在去甲基MCLR(Demethyl MCLR)。根據(jù)雙電荷分子離子(M+2H)2+m/z=491.3的MS/MS圖譜初步推測(cè)Demethyl MCLR的分子結(jié)構(gòu)是：[D-Asp3]mcyst-LR、[Dha7]mcyst-LR、[D-Asp3，(E)-Dhb7]mcyst-LR或者[D-Asp3

6、，(Z)-Dhb7]mcyst-LR。對(duì)結(jié)合固相萃取(SPE)技術(shù)的藻細(xì)胞的胞內(nèi)毒素提取流程進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的毒素提取流程如下：離心收集純培養(yǎng)藻液，于藻漿中加入w(甲醇)=75％提取液，反復(fù)凍融3次，后輔以超聲破碎0.5h，離心收集上清液并過(guò)C18固相萃取柱進(jìn)行富集，然后用w(甲醇)=10％淋洗液對(duì)C18固相萃取柱進(jìn)行淋洗以除去雜質(zhì)，最后用w(甲醇)=80％+w(TFA)=0.05％洗脫液將毒素洗脫收集。
　　 結(jié)合對(duì)MCLR

7、和Demethyl MCLR具有良好交叉反應(yīng)性的酶聯(lián)免疫試劑盒，測(cè)定并分析UV/H2O2抑藻過(guò)程中胞內(nèi)胞外毒素的變化。結(jié)果表明，UV/H2O2主要通過(guò)產(chǎn)生的·OH迅速降解藻細(xì)胞的胞外毒素，同時(shí)通過(guò)抑制藻細(xì)胞生物量和藻毒素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量從而減少藻細(xì)胞的胞內(nèi)毒素合成量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藻液在經(jīng)38 mJ/cm2 UV254輻照結(jié)合0.2 mM H2O2處理后的培養(yǎng)過(guò)程中，藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，在此過(guò)程中胞內(nèi)毒素逐漸釋放至水體，胞外毒素逐

8、漸增加，藻液總毒素含量基本保持不變。
　　 3.UV/H2O2對(duì)微囊藻毒素的降解動(dòng)力學(xué)研究
　　 本論文對(duì)比研究了UV254、H2O2及UV/H2O2對(duì)MCLR的降解效率，結(jié)果表明：1)H2O2幾乎不能氧化降解MCLR，UV254直接光解以及UV/H2O2都能較好的降解MCLR。當(dāng)pH值為8.0、UV254輻照強(qiáng)度為1738μW/cm2、H2O2濃度為5mM時(shí)，第40 min三種處理對(duì)MCLR的降解效果存在明顯差異，其中

9、H2O2對(duì)MCLR的降解率僅為8.4％±2.1％、UV254直接光解去除率為73.6％±3.4％、UV/H2O2處理效果最好(去除率為98％±+4.8％)。2)三個(gè)處理過(guò)程均能較好的擬合表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，其表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為kH2O2=0.0021 min-1、kUV=0.045 min-1和kUV/H2O2=0.082 min-1。kUV/H2O2值超過(guò)kH2O2與kUV之和，表明UV/H2O2具有明顯的協(xié)同作用。
　　

10、 UV/H2O2對(duì)MCLR的降解過(guò)程受初始H2O2濃度、UV254輻照強(qiáng)度、MCLR初始濃度以及溶液pH值的影響。當(dāng)H2O2在0-10mM濃度范圍內(nèi)，UV/H2O2對(duì)MCLR降解的表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)與H2O2濃度呈正相關(guān)關(guān)系：k=0.007×[H2O2]+0.0446，(R2=0.9918)；UV/H2O2對(duì)MCLR的降解效率隨UV254輻照強(qiáng)度的提高而增加，隨MCLR初始濃度的提高而降低，MCLR降解的表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)與MCLR初

11、始濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系：k=-0.0056×[MCLR]0+0.1771(R2=0.8528)。
　　 此外，本論文選取硝基苯(NB)作為競(jìng)爭(zhēng)參考物質(zhì)，根據(jù)UV254光解和·OH氧化MCLR的原理和·OH穩(wěn)態(tài)理論建立UV/H2O2降解MCLR的競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)模型，并結(jié)合模型測(cè)定了·OH與MCLR的二級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)(k=2.8(±0.21)×1010M-1s-1)。
　　 4.UV/H2O2降解微囊藻毒素的中間產(chǎn)物及途徑研究

12、　　 結(jié)合LC-MS分析，基于總離子流圖譜(TIC)及(M+H)+m/z數(shù)據(jù)，結(jié)果表明UV/H2O2降解MCLR過(guò)程主要生成9種中間產(chǎn)物，其正離子質(zhì)荷比分別為(M+H)+m/z1029.5、(M+H)+m/z1011.5、(M+H)+m/z795.4、(M+H)+m/z835.4、(M+H)+m/z811.3、(M+H)+m/z1027.5、(M+H)+m/z1009.5、(M+H)+m/z965.5和(M+H)+m/z1045.5。

13、
　　 UV/H2O2降解MCLR過(guò)程中主要涉及·OH降解、氧化降解以及UV254直接光解作用?！H主要進(jìn)攻MCLR分子Adda側(cè)鏈上的共軛雙鍵、苯環(huán)及甲氧基。根據(jù)中間產(chǎn)物的分子量信息及·OH與多肽和蛋白質(zhì)反應(yīng)機(jī)理等資料信息，推測(cè)UV/H2O2對(duì)MCLR降解途徑主要有3條，分別如下：1)·OH進(jìn)攻Adda側(cè)鏈共軛雙鍵，通過(guò)親電加成反應(yīng)生成4，5-二羥基衍生MCLR或者6，7-二羥基衍生MCLR，然后相應(yīng)的Adda側(cè)鏈C4-C5

14、雙羥基鍵或C6-C7雙羥基鍵氧化斷裂，生成醛或酮衍生中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物進(jìn)一步被氧化生成相應(yīng)的羧酸衍生物；2)·OH進(jìn)攻Adda側(cè)鏈苯環(huán)，通過(guò)親電取代反應(yīng)生成(ortho、meta或para)苯環(huán)羥基衍生MCLR或苯環(huán)雙羥基衍生MCLR，然后進(jìn)一步氧化生成醛或酮衍生中間產(chǎn)物；3)·OH進(jìn)攻Adda側(cè)鏈甲氧基，通過(guò)奪氫反應(yīng)生成甲酸酯衍生MCLR，然后與·OH進(jìn)一步反應(yīng)，生成去甲氧基MCLR(DmADDA)。結(jié)合中間產(chǎn)物含量的時(shí)間變化過(guò)程