厭氧氨氧化細菌的菌種鑒定方法的優(yōu)化及運用研究.pdf

1、本論文采用一系列分子生物學(xué)的方法對具有厭氧氨氧化功能的ASBBR反應(yīng)器中的污泥進行微生物的定性分析,建立了定量分析的體系,以期為反應(yīng)器的運行狀況和反應(yīng)機理提供技術(shù)支持。
　　首先采用MPfastDNAspinKit(forsoil)試劑盒提取DNA,然后設(shè)計特異性引物進行PCR擴增;將PCR擴增得到的產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE),可以反映活性污泥中微生物的多樣性;并將清晰的條帶(優(yōu)勢菌)割膠回收,回收的產(chǎn)物再次PCR,送至

2、上海生工進行克隆和測序,并要求返還質(zhì)粒;將得到的序列進行BLAST比對,建立系統(tǒng)發(fā)育樹,達到對厭氧氨氧化細菌的定性分析;用質(zhì)粒做實時定量PCR,先建立標(biāo)準曲線,今后便可作為其他樣品定量的標(biāo)準,以達到定量的目的。
　　實驗結(jié)果表明:ASBBR反應(yīng)器的污泥里同時存在著厭氧氨氧化菌和好氧氨氧化菌。通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)觀察了兩種菌的多樣性,發(fā)現(xiàn)好氧氨氧化菌的種類比厭氧氨氧化菌的種類多。將厭氧氨氧化菌的圖譜上兩條優(yōu)勢條帶進行割膠

3、回收、克隆并測序。結(jié)果表明,這兩個樣品的序列完全相同;將測得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,進行BLAST比對,并建立系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)與GenBank上已經(jīng)公布的厭氧氨氧化菌同屬分支很深的浮霉細菌(planctomycete(AJ131819))的同源性為99％,可以認為是浮霉菌屬的一種。將好氧氨氧化菌圖譜上的兩條優(yōu)勢條帶進行克隆和測序,得出兩種不同的序列,發(fā)現(xiàn)這兩種菌均屬于氨單加氧酶。因此ASBBR反應(yīng)器中存在的厭氧氨氧化菌和好氧氨氧

4、化菌存在著協(xié)同作用:原水中帶入反應(yīng)器中的氧氣可由好氧氨氧化細菌消耗,把氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽;氧氣消耗完后,厭氧氨氧化細菌則利用剩余的氨和亞硝酸鹽進行anammox反應(yīng)。因而,反應(yīng)器中的氨氮與亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化比值為1.30,低于理論的anammox反應(yīng)計量比1.32。
　　對厭氧氨氧化菌的圖譜上兩條優(yōu)勢條帶克隆后,將其中一個樣品做實時定量PCR,建立了標(biāo)準曲線,可用于其它厭氧氨氧化污泥的定量分析。
　　厭氧氨氧化工藝以其無需氧氣、