來(lái)曲唑和阿特拉津?qū)δ圉q性別分化相關(guān)基因表達(dá)模式的影響.pdf

1、來(lái)曲唑（letrozole）是人工合成的芐三唑類衍生物，其可以抑制細(xì)胞色素P450芳香酶的活性，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)雌激素水平的下降，一般用于乳腺癌的化療和放療。阿特拉津（atrazine）又名莠去津，屬三氮苯類除草劑，主要用于林果地和玉米田中一年生雜草的防治。近年來(lái)，有許多報(bào)道在城市污水、地表徑流、河流和湖泊中檢測(cè)到了來(lái)曲唑和阿特拉津的存在。由于來(lái)曲唑和阿特拉津不易降解，殘效期長(zhǎng)和具有內(nèi)分泌干擾作用的特點(diǎn)，其對(duì)水生環(huán)境和人類的健康已經(jīng)構(gòu)成了

2、潛在的威脅。
　　本研究采用組織學(xué)和分子生物學(xué)方法來(lái)研究不同濃度的來(lái)曲唑(25μg/L，125μg/L，625μg/L)和阿特拉津(26.80μg/L，268μg/L，2680μg/L)暴露成年泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）7天，14天，21天后，雌性和雄性泥鰍性腺組織學(xué)變化，性別分化相關(guān)基因表達(dá)的變化。并通過(guò)利用高通量測(cè)序技術(shù)建立正常泥鰍和來(lái)曲唑以及阿特拉津處理后泥鰍的精巢、卵巢miRNA表達(dá)譜，初

3、步探討來(lái)曲唑和阿特拉津處理下miRNA對(duì)泥鰍性腺發(fā)育和分化的影響。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，625μg/L來(lái)曲唑處理的雌魚(yú)初級(jí)卵母細(xì)胞的數(shù)量顯著減少;雄魚(yú)出現(xiàn)生精小管管腔擴(kuò)張和精子數(shù)量的增加。六個(gè)性別發(fā)育和分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，包括sox9a(sry-related HMG box-9a)，sox9b(sry-related HMGbox-9b),sf1(steroidogenic factor-1),dmrt1(double

4、sex and mab-3 related transcription factor1)和amh(anti-Mullerian hormone)在精巢或卵巢中上調(diào)，但在兩性的大腦中沒(méi)有發(fā)生變化或者降低，除了ar(androgen receptor)表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。其他四個(gè)基因cyp19a(cytochrome P45019a),foxl2(winged helix/forkhead transcription factor2),e

5、rα(estrogenreceptorα)和erβ(estrogen receptorβ)在大腦和性腺中的表達(dá)則表現(xiàn)出濃度依賴性并具有性別和組織特異性。阿特拉津?qū)δ圉q的24h、48h、96h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為31.60mg/L、26.82mg/L、18.98mg/L，安全質(zhì)量濃度(SC)為5.8mg/L。隨著阿特拉津濃度的升高和處理時(shí)間的增長(zhǎng)，泥鰍的死亡率出現(xiàn)明顯的上升。通過(guò)組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高濃度的阿特拉津(2680μg/L

6、)能夠抑制泥鰍精巢精子的發(fā)生，促進(jìn)卵巢細(xì)胞的發(fā)育。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比不同劑量的阿特拉津能夠顯著的促進(jìn)cyp19a，foxl2，erβ，sf1等基因的表達(dá)，而erα表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。對(duì)sox9a，sox9b，dmrt1和amh具有顯著的抑制效應(yīng)。利用高通量測(cè)序技術(shù)分別建立了成熟泥鰍正常精巢和卵巢以及來(lái)曲唑、阿特拉津分別處理8h、24h的精巢和卵巢小RNA文庫(kù)，測(cè)序結(jié)果表明:泥鰍性腺中絕大多數(shù)短序列小RNA，長(zhǎng)度集

7、中在27-28bp，推測(cè)泥鰍性腺中存在大量的piRNA。利用加尾法設(shè)計(jì)引物，對(duì)兩個(gè)對(duì)比組（DC-S24hAC和DX-S24hLX）中隨機(jī)選取的表達(dá)具有顯著差異的兩個(gè)已知的泥鰍miRNA和兩個(gè)新預(yù)測(cè)的泥鰍miRNA(miR-138-x，miR-335-x，novel-m0694-5p, novel-m0301-3p; miR-130-x,miR-205-x, novel-m0279-5p,novel-m0333-5p)進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)

8、證，結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明通過(guò)高通量測(cè)序獲得的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)是可信的。利用三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)全部1442個(gè)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)到共有143549個(gè)靶基因?qū)?yīng)6415895個(gè)靶基因位點(diǎn)。在對(duì)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果分析中，我們預(yù)測(cè)得到了與性別相關(guān)的幾個(gè)基因(foxl2，erα，erβ，ar，dmrt3，cyp17等)。通過(guò)分析每個(gè)基因所對(duì)應(yīng)的miRNAs，結(jié)合樣品間差異表達(dá)miRNAs的數(shù)據(jù)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)一些miRNAs(mi