異種移植ppt課件

1、異種移植研究進展 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科,夏國偉,臨床器官移植發(fā)展史： 1954年Murray首次施行同卵雙生姐妹間的腎移植獲得成功； 1959年Murray和Hamburger各自為異卵雙生同胞間施行腎移植，受者接受全身照射使移植腎獲得長期存活； 1961年Hitchings等將硫唑嘌呤用作嘌呤代謝的抑制劑，抑制抗體的產(chǎn)生，并延長兔皮膚同種移植物的存活。 1962年Murray施

2、行首例尸體腎移植，受者服用硫唑嘌呤獲得長期存活。 自此，現(xiàn)代器官移植時期正式開始。 由于以上貢獻，Hitching和Murray分別榮獲1989年、1990年諾貝爾獎金。,隨著外科技術（血管吻合技術），組織器官低溫保存技術的進步及免疫抑制藥物（特別是環(huán)孢素）控制排斥反應的成功，臨床同種異體移植飛速發(fā)展。 移植種類逐步擴大到心、肝、脾、肺、小腸、骨髓、骨、關節(jié)及胰島細胞等幾乎所有重要臟器和組織。

3、 移植對象也擴展到兒童和老人，器官及組織移植已成為拯救臟器終末性病變的唯一有效手段。 器官短缺已成為全球性的難題，越來越多的患者在等待器官中死去； 人們積極探索異種移植的可能性。,一，異種移植的歷史與現(xiàn)狀 1905年Princeteau將兔腎切成片，移植于病人的腎包膜下，以治療尿毒癥，結(jié)果并無功能，但開創(chuàng)了異種移植在臨床應用的先例。 此后人們又進行過豬、羊、猴的全腎移植給人的嘗試，由于完

4、全沒有應用免疫抑制療法，均未成功。,1964年在移植醫(yī)學史上可稱為異種移植年。Reemtsma、Hitchcock、Starzl先后施行猩猩、猴、狒狒對人的異種腎移植，共18例，達到4日至9個月的成活； Hardy施行第一例猩猩對人的異種心臟移植，但因心輸出不足而失敗。 此后，隨著同種移植進入現(xiàn)代免疫抑制治療時期，移植成績顯然優(yōu)于異種移植，異種移植進入低潮時期。,但60年代的異種移植研究取得了兩個進展： 首先Ki

5、sseyer-Nielson等報道，1例同種移植因發(fā)生“超急性排斥”而失敗，研究者認為與受者血液中存在著抗供體抗體有關； 第二是Perper與Najarian發(fā)現(xiàn)異種移植兩種根本不同的后果。種系關系較近的移植如羊和山羊、黑猩猩和人，移植物在發(fā)生排斥反應前可行使一段時間的功能，類似于同種排斥反應。而種系關系較遠的異種移植如狗和豬、豬和人，其結(jié)果則完全不一樣，這種異種移植因發(fā)生超急排斥反應而失敗。,1970年，Calne根據(jù)對異種移

6、植的觀察，首次提出異種移植的協(xié)調(diào)性和不協(xié)調(diào)性概念。 異種移植種系組配中，不產(chǎn)生超急性排斥的屬于“協(xié)調(diào)性”（Concordant）反應，這種移植供受體間進化關系較近，存活以日為計，類似于第一次同種移植排斥，如猩猩給人，狗與狼、大鼠與小鼠之間均屬此類； 產(chǎn)生超急性排斥的屬于“不協(xié)調(diào)性”（discordant）反應，該種移植供受體間進化關系較遠，排斥以分成小時計算，類似于第二次接觸抗原的同種排斥反應。 超急性排斥反應成

7、為異種移植在臨床應用中難以逾越的障礙，此分類法具有科學性和臨床適用性雙重價值。,Hasan等將Concordant又進一步分為困難型和容易型： 如倉鼠對大鼠的移植，應用抑制抗體產(chǎn)生的藥物如環(huán)磷酰胺可延長移植物存活，但即使加上環(huán)孢素A也不能誘導出耐受，因而為Concordant困難型； 而抗CD4T淋巴細胞單抗可以誘導大鼠對小鼠心臟移植耐受，因而為Concordant容易型。 據(jù)此，狒狒對人為困難型；猩猩對人為容易型；而

8、豬對人則為discordant。,人們在70～80年代相繼進行了猩猩對人肝移植，狒狒、猩猩對人的心臟移植，但結(jié)果均未獲長期存活。 隨著環(huán)孢素而來的同種移植巨浪幾乎完全將異種移植淹沒。,由于同種移植的飛速發(fā)展，供體缺乏的矛盾日益突出，停頓多年后，異種移植又于1992年重新開始。 活動性乙肝被認為是同種肝移植的禁忌征，Starzl認為狒狒肝對乙肝病毒不易感，從而為該類患者進行了狒狒肝異種移植治療，術后使用FK506、潑尼松、

9、環(huán)磷酰胺及前列腺素，但第一例患者術后70天死于由真菌感染引起的腦出血，尸檢未發(fā)現(xiàn)狒狒肝有肝炎樣損害。第二例患者術后26日死于腹膜炎和敗血癥。第三例患者為自身免疫性肝炎，肝昏迷腦水腫。行豬異種肝移植作為暫時過渡，手術非常成功，肝有功能并產(chǎn)生膽汁，腦壓及凝血機制恢復正常，但術后第三日因腦壓回升，在同種供肝移植前死去。,由于異種移植困難重重，移植界重新回到了對異種移植價值和基本理論再度深入探討的平靜時期，也就是說除基礎研究外再也沒有任何魯莽的

10、異種移植臨床報告。 但人類可以從這些嘗試中得出以下結(jié)論并對異種移植懷有信心：①異種器官曾在人體內(nèi)發(fā)揮過功能并能維持一段時間生命；②異種排斥可以用抗同種排斥的方法逆轉(zhuǎn)，說明異種排斥過程至少在某些方面與同種排斥相同；③有些異種移植患者可以長期存活（9個月），說明異種移植有可能獲得成功。,二，異種移植抗原和異種移植免疫的認識 豬等哺乳動物細胞表面存在大量作為糖蛋白或糖脂質(zhì)部分構成成分a-半乳糖鏈（a-galactosy

11、l,a-Gal）抗原，它被公認為存在于除舊世紀靈長目以外的哺乳動物體內(nèi)的異種抗原，是針對人等靈長類的主要異種抗原決定簇。,除a-gal抗原外，尚有非 a-gal抗原的存在與分布： Oriol研究發(fā)現(xiàn)，與人類ABO血型抗原相對應的A＋/A－豬的抗原分布； Tn和Fossman抗原，經(jīng)吸附去除抗 a-gal抗體的人血清與HTg轉(zhuǎn)染小鼠脾細胞強烈反應，可推測人血清中存在抗Tn和抗Fossman天然抗體。 經(jīng)TNF誘導的

12、血管內(nèi)皮細胞表達gp65和gp100，gp65亦可由IL－1誘導表達。這兩種抗原均非 a-gal抗原，但都能被天然抗體識別。 此外豬的主要組織相容性抗原SLA-I和SLA-II也可能是非 a-gal抗原。,非 a-gal抗原物質(zhì)與 a-gal抗原同時在異種移植免疫排斥中成為攻擊對象或被宿主免疫系統(tǒng)識別； 亦可能在正常情況下是隱匿抗原，在 a-gal被去除時成為主要靶抗原。一些特定細胞因子誘導表達的抗原可能是超急排斥的靶抗

13、原。,異種移植免疫 天然抗體預先存在于受者血液循環(huán)中，是由CD5+B細胞產(chǎn)生的，Cramer發(fā)現(xiàn)在許多種屬中，都是由同一種基因編碼產(chǎn)生天然抗體，主要為IgM。 天然抗體識別的靶抗原在不同種屬間也是不同的。在豬－靈長目動物間，狒狒、猴等的天然抗體主要識別豬內(nèi)皮細胞上的一種表面糖蛋白Gp115/135，而不是糖脂或磷脂。天然抗體與內(nèi)皮細胞的結(jié)合可被不同的糖蛋白酶清除，主要的抗原決定簇是定位于糖蛋白聯(lián)系的低聚糖上，即a-ga

14、l抗原。,1，超急排斥反應（Hyper acute rejection,HAR） 異種移植后數(shù)分鐘到48小時內(nèi)發(fā)生。比較公認的機制為：受者體內(nèi)的天然抗體與供者器官內(nèi)皮細胞上的異種抗原（a-gal）結(jié)合，激活受者補體系統(tǒng)（經(jīng)典或替代途徑），進而激活血管內(nèi)皮細胞，激活血小板，引起血栓形成，使移植物缺血壞死。,2，遲發(fā)性異種排斥反應（Delayed xenograft rejection,DXR） 發(fā)生在異種移植術后4～5天

15、，是在排除了發(fā)生HAR的因素后發(fā)現(xiàn)的一種排斥反應。病理特點是移植物局灶性缺血梗塞，廣泛的微小血管內(nèi)血栓形成，大量的單核細胞和少許自然殺傷細胞（NK）浸潤。免疫熒光染色未發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白、補體的沉積，不同于HAR、血管性排斥和T細胞介導的急性、慢性排斥后的病理改變。 單核細胞參與DXR的機制：通過P－選擇素、單核細胞、NK細胞與EC結(jié)合，導致EC激活，血小板聚集并激活，微血栓形成；盡管參與DXR的粒細胞數(shù)量少，但通過巨細胞粘附分子誘

16、導，聯(lián)合上述化學因子上調(diào)異種靶抗原，加重了DXR炎癥反應。,3，急性血管性排斥（Acute vascular xenograft rejection,AVR）,或稱加速性急性排斥。 見于近緣器官移植或控制了HAR的遠緣移植。機理為異種移植物植入受體后，受體繼發(fā)產(chǎn)生機體，與供體EC上的a-gal結(jié)合，致EC活化，引發(fā)血栓形成[10、11]。病理特點、移植物出血、水腫、實質(zhì)壞死，有中性粒細胞及巨噬細胞浸潤，與HAR類似。但免疫細胞

17、檢查無異種補體沉著，有異種IgM、LgG?？贵w依賴的細胞毒作用可能在其中起作用。,4，急性細胞性排斥、慢性排斥 體液免疫仍是目前異種移植的難題，在沉有根本解決這一難題前，細胞免疫的研究尚未深入。但異種皮膚、胰島移植被認為以細胞免疫為主，臨床表現(xiàn)有如同種細胞免疫的相似處，實驗也表明異種細胞識別包含直接和間接途徑，但亦有其自身特點。 同樣，因異種移植尚無長期存活病例，但可預測在克服以上排斥反應后，慢性排斥可能發(fā)現(xiàn)。至于其機理

18、和誘發(fā)因素，現(xiàn)在討論為時尚早。,5，異種移植中的GVHR 早在二十世紀50年代就發(fā)現(xiàn)，將有免疫活性細胞的同種異體組織植入免疫系統(tǒng)被抑制的受體后，有的動物會“神秘”地死亡。尸檢發(fā)現(xiàn)受者淋巴器官萎縮而無感染表現(xiàn)，以后在同種移植的患者中也發(fā)現(xiàn)類似情況，稱為移植物抗宿主反應（GVHR）。隨后在80年代未和90年代初，Mosier及Lubin先后報道了在有免疫缺陷的小鼠中植入人類外周血淋巴細胞，在小鼠體內(nèi)建立人類免疫系統(tǒng)的模型中，觀察到異

19、種GVHR（XGVHR）。 XGVHR的誘發(fā)條件：盡可能摧毀受者的免疫系統(tǒng)，使其免疫力極度低下，如應用先天免疫缺陷或生理性免疫低下的動物，術前給予受者免疫抑制劑或行TBI、BMT后給予受者IL－2促發(fā)XGVHD；然后經(jīng)腹腔或靜脈注射植入有免疫活性的異種淋巴細胞（如人類PBLC）。,XGVHR的機制：1）細胞免疫：T細胞、NK細胞、巨噬細胞參與可XGVHR，其中還有CK的作用。但觸發(fā)XGVHR的抗原是什么，信息傳遞過程中粘附因子，

20、第二信號系統(tǒng)起什么作用，與同種GVHR機制有何異同等尚待進一步研究；2）體液免疫：在受體小鼠內(nèi)植入的人類B細胞如能正常工作，則能產(chǎn)生針對小鼠的異種天然抗體XNA，從而發(fā)起對宿主的攻擊。在XGVHR鼠腎小球中也檢測出多克隆的人類Ig，這說明體液免疫參與了XGVHR，但具體方式及細節(jié)仍不清楚。 XGVHR的病理特點：1)急性XGVHR時，受體鼠脾臟、骨髓、胸腺、肝臟、腎、小腸及皮膚均可見人類淋巴細胞浸潤；2)慢性XGVHR的病理特征

21、為廣泛的血管周圍炎，造血組織內(nèi)主要以人CD8＋細胞浸潤為主。,6，適應（Accommodaton） 某些病例中，如在移植前除去抗體，并維持無抗體狀態(tài)達到一定時間，于是觀察令人吃驚的現(xiàn)象，盡管循環(huán)抗體水平隨即回升，并有補體的存在，而移植物卻繼續(xù)存活下去，不發(fā)生異種移植的超急排斥反應，這種抗體對抗原的“停戰(zhàn)”狀態(tài)稱之為適應（Accommodaton）。 適應是一種狀態(tài)，其可能機制為：1)適應前后，受者體內(nèi)的抗體在某些重要特征

22、上發(fā)生了改變；2)在自然抗體清除或抑制時期，移植物內(nèi)皮細胞表面表達的抗原性發(fā)生了變化；3)內(nèi)皮細胞對兩種抗體（天然抗體和適應后再產(chǎn)生的抗體）的反應不同。,MHC在異種移植中的作用 MHC為主要組織相容性復合物，在人類為人白細胞抗原HLA。MHC能夠約束免疫細胞間的相互作用。早期研究發(fā)現(xiàn)，細胞毒性T細胞只能殺傷具有同一MHC表型的病毒感染的靶細胞，即T細胞在識別細胞表面抗體決定簇的同時，還必須識別細胞上的MHC分子。以后證實，Tc

23、、MO、TH、B、靶細胞間相互作用也受同樣的限制。具有同一MHC表型的免疫細胞間才能有效地相互作用，這一現(xiàn)象稱為MHC限制性。,同種移植中，外來抗原的呈遞識別方式有兩種：直接識別和間接識別。直接識別（direct recognition）又稱同種限制性（allo-restriction），是指宿主T細胞表面的抗原受體識別自身肽－同種MHC，致極強的初次反應；間接識別（indirect recognition）又稱自身限制性（self-r

24、estriction），是指抗原呈遞細胞APC將外源肽－自身MHC以復合物方式呈遞移植抗原，其初次反應弱，但隨著時間的推移逐步增強，對移植物產(chǎn)生特異性排斥。,Yamada的研究表明，人類T細胞也能直接和間接識別豬的MHC（SLA－Ⅱ抗原），但由于種間差異，豬與人的相互作用不如人同種異體間緊密，故主要依靠間接途徑呈遞抗原，這也是異種MLR比同種MLR增殖反應低的原因。而不同型豬一人組合的MLR反應強弱不同，說明MHC的適配性在異種移植中起

25、仍起主要作用，提示是否需要對豬與人進行MHC配型值得進一步研究。,三、目前異種移植研究的對策 1、在體液免疫方面，針對天然和繼發(fā)的抗體，可采?。孩傺獫{置換法，可清除大量抗體，但抗體水平可很快恢復。②器官吸附法，即用受者血液灌注供者離體器官，使抗體與異種抗原結(jié)合，但抗體也會很快回升。③采用層折柱吸附法，與脾切除、抑制B細胞藥物配伍使用。④靜脈給予人工提成和合成的a—gal相似結(jié)構糖，中和天然抗體。⑤單克隆抗體，針對u鏈的單抗

26、可抑制體液免疫。,針對補體：①眼鏡蛇毒因子可消耗補體，但需反復給藥、毒付作用大，費用高，只能短期使用；②補體變加速因子（DAF）、補體抑制劑K76COOH、FuT175、可溶性補體受體等可抑制補體活性。 針對性EC：①抗體封閉EC表面的粘附因子；②用a—半乳糖酐酶處理移植物內(nèi)皮，去掉a—gal。,2、基因工程技術 針對XNA：用基因敲除法或干擾該基因表達，使a—gal糖基轉(zhuǎn)移酶基因失活，致使細胞表面不能或減少表達a—ga

27、l糖基轉(zhuǎn)移酶，進而不能或減少表達a—gal異種抗原。 針對補體：正常抗體內(nèi)的補體激治受一些因子或調(diào)節(jié)蛋白抑制，如DAF（CD55）、CD501、膜輔蛋白。在異種器官細胞上不表達人類的這些調(diào)節(jié)因子而不能抑制人類補體活性。 通過基因工程使異種器官細胞膜上表達人類的調(diào)節(jié)因子，則可抑制人類補體治而克服超急排斥反應。如英國、美國分別培育出轉(zhuǎn)人DAF、CD501基因豬，體外實驗證明能減弱人補體的治性。 針對EC：抑制轉(zhuǎn)錄因NF—KB

28、可防止EC治療，那么導入NF—KB的抑制基因，則可阻止EC治療。,3、免疫抑制療法 聯(lián)合應用免疫抑制藥物，如環(huán)磷酰胺、FK506、Rapamycin等藥物，似可抑制異種排斥，但缺點是全面免疫抑制，受體極易感染而致命，需尋找特異性免疫抑制劑，或誘導免疫耐受。,4、適應 實驗證明，如果移植前清除受者體內(nèi)的天然抗體，并維持無抗狀態(tài)一定時間后，即使移植后循環(huán)中的天然抗體回升，并有補體存在，將不發(fā)生異種超急排斥反應，這種狀態(tài)，稱為適

29、應。 因此，我們可以主動誘導適應狀態(tài)，如采用血漿置換、免疫吸附、抗B細胞制劑等在移植前消除受體抗體，有關該方面的實驗還在進行。,5、抗凝治療 從病理組織學上看，異種移植超急排斥反應的過程最后均有凝血系統(tǒng)的參與，其中尤以血小板在局部的聚集最為重要，所以防止凝血連鎖的活動可能會延緩異種超急排斥反應的發(fā)生。 實驗顯示，給異種器官移植前動脈灌注構椽酸鈉可使移植腎存活時間明顯延長；采用血小板激活因子拮抗劑RP—59227或

30、SRI—63441來防止血小板聚集和打斷凝血連鎖，也可使異種移植物存活延長。,6、對抗中性粒細胞粘附 內(nèi)皮細胞激活可產(chǎn)生多種粘附分子，導致中性粒細胞、血小板、活性蛋白粘附于內(nèi)皮細胞表面，針對CFA-1、ICAM-1等粘附分子的單克隆抗體能阻止異種移植排斥發(fā)生，延長存活時間，但不能逆轉(zhuǎn)已形成的排斥反應。7、誘導免疫耐受 實驗證明，水溶細胞型抗CD4和CD8單克隆抗體可以誘導大鼠對小鼠的異種心臟移植免疫耐受。如與RS-6

31、1443聯(lián)用，還可以誘導出大鼠對小鼠的皮膚移植免疫耐受。前者控制T細胞反應，后者抑制抗異種抗體的產(chǎn)生。,8、DXR的預防和治療措施 針對DXR的發(fā)生發(fā)展機理，目前的防治策略為：①因為DXR是由于單核巨噬細胞聚集、激活，從而激活了供體EC而發(fā)生。因此阻斷凝集與內(nèi)皮細胞的相互作用，可能會防止DXR；②應用血小板活化因子（PAF）拮抗劑或抗巨噬細胞凝集素單克隆抗體阻斷激活巨噬細胞、NK細胞和促進凝血的凝集素功能；③通過基因工程，將調(diào)控

32、巨噬細胞、NK細胞應答、局部凝血和內(nèi)皮細胞激活的基因表達于供器官，有可能治療DXR。,9、XGVHD 借鑒于GVHD，有關XGVHD的發(fā)生，發(fā)展及防治研究還在進行。10、異種急性、慢性排斥反應 體液免疫仍是目前異種移植的難題，在沒有圓滿解決這一難題前，細胞性免疫的研究不可能深入，有關該方面的研究有待進行。,四、異種移植存在的問題1，異種感染（Xenosis） 現(xiàn)已知約150多種感染物可以從動物傳染給人類，病毒感

33、染可能是術后主要并發(fā)癥，尤其是強大的免疫抑制壓力之下。目前關注的問題是：①動物病毒經(jīng)移植物傳染給病人；②移植病人再將這些病毒在人群中傳播。這種病毒本身或通過與人類病毒的基因重組有可能產(chǎn)生一種難以控制的新病毒，這種病毒在人類中傳播，后果十分嚴重。為此英國政府曾于1997年底明令，在沒有充分安全保證的情況下，禁止轉(zhuǎn)基因動物器官在人體應用。,2，分子不相容性（Molecular incompatibility） 機體的組織器官是一個在

34、功能上協(xié)調(diào)一致的整體，各組織器官之間是的信息傳遞是通過各種分子與其相應的細胞膜分子受體的結(jié)合來傳遞的。這些信號分子與膜受體之間的相互作用，就是機體內(nèi)部各組織器官相互通訊的分子語言系統(tǒng)。不同種屬的動物，其分子由于結(jié)構上的差異，有可能不能有效地與其它動物的膜受體結(jié)合，從而中斷了信息傳遞途徑，導致功能喪失。現(xiàn)已表明，異種分子之間有時可以替代，有的則不可以。異種移植排斥和異種分子不相容性是生物長期進化過程，為保護種屬穩(wěn)定而形成的種屬屏障，這是異

35、種移植面臨的嚴重挑戰(zhàn)。,3，社會倫理學問題 最直接的考慮莫過于移植異種肝臟、心臟及腦組織后，是否也將動物的某些屬性“傳染”給人，受者性格、行為等有無明顯改變，食性有否變化（因肝臟是營養(yǎng)代謝的中心器官），特別是卵巢、睪丸等會不會被人秘密用于試驗或臨床，引起倫理紊亂。,五、異種移展望 豬易于繁殖，成熟期短，一胎多子，數(shù)量多，可在潔凈無病原體環(huán)境下培育近交系和遺傳工程供體；豬的器官大小、形狀與人類相仿

36、，所患疾病易于控制，在倫理學方面相對靈長類動物更易接受，豬有可能成為異種移植最理想的供體源。 異種移植可以突破種屬屏障，從科學角度看，不論成功與否，加強異種移植的基礎研究不但具有實踐意義，更能揭示自然規(guī)律。,轉(zhuǎn)基因動物在異種移植的道路上邁出了重要的一步。 克隆羊的成功，使得我們可以利用克隆技術培育純系動物。那么轉(zhuǎn)基因技術和克隆技術的有機結(jié)合，有可能加快異種移植臨床實用化進程。 最近，人