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文檔簡介
1、鎘(Cd)是廣泛存在于自然界的一種重金屬元素,一氧化氮(NO)是一種普遍存在于生物界的信使分子,廣泛參與植物對各種環(huán)境脅迫包括Cd脅迫的應(yīng)答與反應(yīng)和調(diào)控的過程,紫花苜蓿(Medicogo sativa L.)具有清除土壤中高含量Cd、Cu或Zn的能力,是一種很有潛力的土壤修復(fù)植物。而對于作物整個生長周期而言,種子的萌發(fā)過程是生理代謝最旺盛的階段。本實(shí)驗(yàn)用氯化鎘(CdC12)模擬Cd脅迫,采用NO供體SNP(Na2[Fe(CN)5NO]·
2、2H2O)、硝酸還原酶(NR)非專一性抑制劑疊氮化鈉(NaN3)、一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NAME(N'-nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride)和NO專性清除劑c-PTIO(2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)分別處理紫花苜蓿種子,通過分析Cd脅迫下紫花苜蓿種子內(nèi)源NO的產(chǎn)生及產(chǎn)生途徑,N
3、O對Cd脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)生長、貯藏物質(zhì)積累、膜脂過氧化、抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和Cd含量的影響,探討NO在植物逆境脅迫響應(yīng)中的作用及其機(jī)理。結(jié)果表明:
(1) Cd脅迫增加了紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中內(nèi)源NO的產(chǎn)生,表明NO信號與紫花苜蓿種子抵抗Cd脅迫有關(guān)。從處理第一天到第五天,NO含量總值呈現(xiàn)顯著性變化。隨著Cd處理濃度的增大,NO含量總體呈現(xiàn)上升趨勢,或先上升后下降但各處理濃度下NO含量均顯著高于對照,這表明Cd脅
4、迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中有內(nèi)源NO的產(chǎn)生,且在50μmol/L Cd脅迫下NO產(chǎn)生量達(dá)到最高峰。
本研究選取了NOS、NR活性,亞硝酸根離子(NO2-)、類胡蘿卜素(Car)含量四個參數(shù)作為內(nèi)源NO產(chǎn)生途徑的代表。結(jié)果表明,隨著Cd處理濃度的增大,第一天、第三天和第四天的NOS活性呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng),即低濃度下增強(qiáng),高濃度下減弱的效果;第二天和第五天的NOS活性總體呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。Cd處理使紫花苜蓿種子體內(nèi)的NO2-、C
5、ar含量發(fā)生了顯著變化。隨著Cd處理濃度的增大,紫花苜蓿種子體內(nèi)的NO2-、Car含量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。四項(xiàng)指標(biāo)總體均與NO含量變化規(guī)律相似,表明Cd脅迫能誘發(fā)紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中內(nèi)源NO的產(chǎn)生,主要通過NOS催化,及NO2-在NR催化作用下或在Car和光的介導(dǎo)作用下產(chǎn)生。
不同濃度Cd處理下,NR五天的活性總量相對NOS活性、NO2-和Car含量而言更平穩(wěn),說明苜蓿種子萌發(fā)過程中NR活性受Cd濃度影響相對較小。第
6、二天的NO含量較第一天相比有總體下降的趨勢,這與NOS、NR、NO2-早期變化規(guī)律均相似,說明種子萌發(fā)初期NOS、NR、NO2-可能起主要的調(diào)控作用。第三天至第五天NO含量逐步增加,這與NOS、Car、NO2-后期變化規(guī)律相似,說明種子萌發(fā)后期NOS、Car、NO2-可能起更主要的調(diào)控作用??傮w而言,50μmol/L Cd處理使NOS、NR活性,NO2-、Car含量顯著增加,NO含量升高也最顯著。
(2) Cd脅迫顯著抑制了紫
7、花苜蓿種子萌發(fā)和生長,使發(fā)芽率、發(fā)芽勢、種子活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù),胚芽長和胚根長以及胚芽、胚根鮮重較對照(CK)顯著降低。外源SNP處理能使上述參數(shù)較CK顯著升高,而Cd脅迫下SNP處理能緩解Cd脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)和生長的抑制作用,使上述參數(shù)較Cd單獨(dú)處理顯著升高,SNP的緩解作用卻被NO的清除劑c-PTIO處理抵消,使上述參數(shù)較Cd+SNP相比顯著下降,表明Cd脅迫可誘導(dǎo)內(nèi)源NO產(chǎn)生,外源和內(nèi)源NO都參與了紫花苜蓿種子對Cd脅迫的響
8、應(yīng)過程,能緩解Cd脅迫對植物萌發(fā)和生長的抑制,增加發(fā)芽率、發(fā)芽勢、種子活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù),胚芽長和胚根長以及胚芽、胚根鮮重。
逆境脅迫下,NOS和NR通過產(chǎn)生NO在植物發(fā)揮著重要的作用。本研究中,Cd脅迫下,L-NAME、NaN3、NaN3+L-NAME處理使胚芽長和胚根長較Cd單獨(dú)處理顯著降低。L-NAME處理下種子胚芽長和胚根長顯著高于NaN3處理。發(fā)芽率和發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)以及胚芽鮮重、干重有著相似的規(guī)律。說
9、明NaN3、L-NAME通過對NR、NOS的抑制顯著阻礙了紫花苜蓿種子萌發(fā)和生長,進(jìn)而表明NR和NOS能通過促進(jìn)內(nèi)源NO的產(chǎn)生,增加Cd脅迫下紫花苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù),胚芽、胚根長以及胚芽鮮重、干重,緩解Cd脅迫對種子萌發(fā)的抑制,且在促進(jìn)紫花苜蓿種子萌發(fā)和生長方面,NR可能比NOS起著更主要的作用。
(3)發(fā)芽過程的特征是通過儲存物質(zhì),如碳水化合物和蛋白質(zhì)等通過水解酶水解新形成的物質(zhì)用于形成新的結(jié)構(gòu)。
10、儲存物質(zhì)被水解酶水解為呼吸作用和各種合成代謝反應(yīng)提供能量,以形成代謝產(chǎn)物。負(fù)責(zé)這些儲備物質(zhì)如淀粉分解的酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶,已有報道顯示,Cd脅迫會導(dǎo)致儲備物質(zhì)的動員受到限制。本研究中,Cd脅迫顯著抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的積累,使還原性糖、可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性較CK顯著降低。而Cd脅迫下,SNP處理能緩解Cd脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)積累的抑制
11、作用,使上述參數(shù)較Cd單獨(dú)處理顯著升高,SNP的緩解作用可被NO的清除劑c-PTIO處理抵消,使上述參數(shù)較Cd+SNP相比顯著下降,表明Cd脅迫誘導(dǎo)內(nèi)源NO產(chǎn)生,NO參與紫花苜蓿種子對Cd脅迫的響應(yīng)過程,緩解Cd脅迫對植物貯藏物質(zhì)積累的抑制作用,增加還原性糖、可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量,促進(jìn)α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性。
Cd脅迫下, L-NAME、NaN3、NaN3+L-NAME處理使可溶性蛋白、
12、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性較Cd單獨(dú)處理顯著降低。相似地,與CK相比,NaN3、 L-NAME、NaN3+L-NAME處理均顯著抑制了種子體內(nèi)的還原性糖、可溶性蛋白、粗脂肪含量和α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶活性。說明NaN3、L-NAME通過抑制NR、NOS的活性從而顯著抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的積累,表明內(nèi)源NO緩解Cd脅迫對種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)積累的抑制,減輕Cd迫
13、害。
(4)作為活性氧化還原金屬,Cd能夠誘導(dǎo)各種非生物脅迫下在幼苗中產(chǎn)生的ROS,如O2-·和H2O2的過度產(chǎn)生,這又導(dǎo)致膜脂過氧化;為了應(yīng)對和中和ROS的毒性,植物發(fā)展的內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)包括CAT,POD,SOD,APX,GR等抗氧化酶。本研究中,Cd脅迫下,紫花苜蓿種子體內(nèi)的MDA、H2O2、O2-·含量、REC與CK相比顯著升高,而SOD、 CAT、POD、APX、LOX活性也相應(yīng)增強(qiáng),進(jìn)一步闡述了上述觀點(diǎn),說明苜蓿
14、通過增強(qiáng)抗氧化酶活性來緩解Cd脅迫引起的膜脂過氧化,從而提高對Cd脅迫的抗性。而Cd脅迫下,SNP處理使種子體內(nèi)的MDA、H2O2、O2-·含量、REC和SOD、CAT、APX、LOX活性較Cd單獨(dú)處理顯著降低,說明Cd脅迫引起了活性氧(ROS)自由基的增加,致使紫花苜蓿種子發(fā)生膜脂過氧化,而外源NO的添加對膜脂過氧化現(xiàn)象有緩解作用;SNP的緩解作用可被c-PTIO處理抵消,使上述參數(shù)較Cd+SNP顯著升高,說明對苜蓿種子體內(nèi)NO的清除
15、會引起活性氧自由基含量水平的增加,進(jìn)而激發(fā)抗氧化系統(tǒng)作用。
Cd脅迫下,NaN3、L-NAME、NaN3+L-NAME處理使種子體內(nèi)的MDA、H2O2、O2-·含量、REC和SOD、CAT、APX、LOX活性較Cd顯著升高,說明NaN3、 L-NAME通過抑制NR、NOS的活性引起了種子體內(nèi)活性氧自由基含量水平的增加,進(jìn)而說明內(nèi)源NO可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的一般機(jī)制,通過增強(qiáng)抗氧化酶活性,清除H2O2,促進(jìn)O2-·轉(zhuǎn)化為H
16、2O2和O2,緩解植物的氧化損傷。
在總體水平上,隨著時間的推移,MDA、H2O2、O2·-、REC、Pro含量水平呈現(xiàn)逐漸積累的水平;而SOD、CAT、APX、GR活性亦呈逐漸增加的趨勢。說明隨著時間的延長,Cd誘導(dǎo)這些分子的過度積累導(dǎo)致了紫花苜蓿種子中的氧化損傷并抑制幼苗生長。另一方面,POD、LOX活性則呈現(xiàn)總體先降低后升高的趨勢,表明NO和POD、LOX活性誘導(dǎo)之間的關(guān)系較為復(fù)雜,具體原因還需進(jìn)一步研究得知。
17、 (5)未外加Cd處理時,紫花苜蓿種子體內(nèi)Cd含量極低,而SNP、L-NAME、NaN3、L-NAME+NaN3、c-PTIO均使苜蓿體內(nèi)Cd含量水平顯著提高,疑似出現(xiàn)“假陽性”效果,原因有待進(jìn)一步研究。
Cd脅迫下,外源SNP處理使種子體內(nèi)Cd積累量較Cd單獨(dú)處理顯著升高,積累量為24.945μg/g; SNP的促進(jìn)效果可因c-PTIO的添加而被抵消,使Cd積累量較Cd+SNP顯著降低;說明外源NO在促進(jìn)植物生長發(fā)育的同時,
18、也增加了植物對Cd的吸收,這與前人在紫花苜蓿幼苗中得到的結(jié)論不一致,可能是由于NO促進(jìn)了Cd的吸收,而部分Cd與一些絡(luò)合物結(jié)合而失活,從而未使Cd的積累對種子萌發(fā)造成致命的損傷。Cd脅迫下,L-NAME、NaN3、 L-NAME+NaN3處理使Cd積累量較Cd單獨(dú)處理顯著降低。說明苜蓿體內(nèi)NO的清除和NOS和NR活性的抑制會降低苜蓿對外界Cd的吸收,這說明內(nèi)源NO參與了紫花苜蓿種子對Cd脅迫的調(diào)控,增加了對外界Cd的吸收及積累。
19、 總體來說,Cd脅迫誘導(dǎo)了內(nèi)源NO的產(chǎn)生,內(nèi)源NO在紫花苜蓿種子萌發(fā)及胚生長、貯藏物質(zhì)、活性氧代謝及Cd積累方面均有顯著調(diào)控作用,而外源NO的添加能促進(jìn)這種調(diào)控作用,逆轉(zhuǎn)Cd對種子萌發(fā)及生長的負(fù)面影響。對NOS、NR活性的抑制及對NO的清除均會抵消SNP處理所帶來的積極作用。本研究促進(jìn)內(nèi)源NO生成的最佳Cd濃度為50μmol/L。
紫花苜蓿在修復(fù)重金屬如Cd、Cu、Pb等污染土壤方面的能力非常突出,而在中國有大面積種植紫花苜
20、蓿作為畜牧業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ),由此可見其在應(yīng)對逆境環(huán)境下的發(fā)展前景很廣闊。光合作用是植物新陳代謝以生長的基本生理活動,對于NO在Cd脅迫下對紫花苜蓿凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及葉黃素循環(huán)是怎樣影響的還有待探討,這是下一步研究的方向和目標(biāo)。建議進(jìn)一步采用遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)分析及其他生理學(xué)方法,以了解外源NO在植物代謝功能中的細(xì)節(jié),這將有助于進(jìn)一步了解這種多面體化合物,用于植物緩解不同種類生物和非生物脅迫,使紫
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