circrna研究進展綜述2017

1、CircRNA 研究進展分享,分享人：滕飛 部門：癌癥業(yè)務(wù)線-轉(zhuǎn)錄組,目錄,CircRNA 介紹CircRNA 研究進展CircRNA文章典型案例分析CircRNA目前生物信息分析流程比較CircRNA 未來研究方向預(yù)測,1979年洛克菲勒大學(xué)的Hsu和Coca-Prados在電子顯微鏡下觀察到的真核細胞細胞質(zhì)中觀測到環(huán)狀RNA的存在,CircRNA,circRNAs（Circular RNAs，環(huán)形RNA

2、分子）是一類不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子,RNase R,circRNA 具體特征：(1)circRNA由特殊的可變剪切產(chǎn)生，大量存在于真核細胞的細胞質(zhì)中，但少部分內(nèi)含子來源的circRNA則存在于核酸內(nèi)，具有一定的組織、時序和疾病特異性;(2)廣泛存在于人體細胞中，有時甚至超過它們線性異構(gòu)體的10倍之多;(3)與傳統(tǒng)的線型RNA(linear RNA

3、，含5＇和3＇末端)不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩(wěn)定;(4)具有高度保守性，部分具有快速的進化性改變;(5)大多數(shù)來源于外顯子，少部分由內(nèi)含子直接環(huán)化形成;(6)部分circRNA分子含miRNA應(yīng)答元件(miRNAresponse element，MRE)，可充當競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)，與miRNA結(jié)合，在細胞中起

4、到miRNA海綿的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，上調(diào)靶基因的表達水平;(7)可以翻譯成蛋白質(zhì)，但大部分是非編碼RNA。,CircRNA,分類標準：來源,exon circRNA定位：細胞質(zhì)功能：miRNA海綿作用,CiRNA,EIciRNAs,,形成來源,功能：circRNA順式調(diào)控親本基因的表達,一方面 circRNA可以與RNA結(jié)合蛋白相互結(jié)合影響親本基因mRNA的表達。另一方面，環(huán)狀RNA形成過程

5、中內(nèi)含子間競爭性互補配對可以與線性RNA之間達成一種平衡，影響mRNA的表達，甚至蛋白翻譯。,,,,功能：海綿作用,miRNA海綿作用（miRNA sponge）：結(jié)合并封閉miRNA的調(diào)控作用，從而使其靶基因表達增強。,海綿作用來源,功能：編碼蛋白質(zhì),大多數(shù) circRNA 存在于胞質(zhì)中,提示它們可以被裝載到核糖體而被翻譯成多肽。 與許多沒有 5'帽和 3'多聚（ A） 尾的線性 mRNA 相似，circRNA 也缺乏

6、有效的翻譯起始結(jié)構(gòu)，但是一旦啟動了一個內(nèi)部核糖體進入位點 （ internal ribosome entry site,IRES） ,兩者都是可以被翻譯的. 丁型肝炎病毒（ hepatitis D virus,HDV） 的核心包含有單股負鏈共價閉合 circRNA 分子，它編碼的相關(guān)蛋白 HDV 抗原（ hepatitis D virus antigen,HDAg） 在疾病發(fā)展中起到了重要的作用.

7、另外，研究者發(fā)現(xiàn)，人骨肉瘤細胞 U2OS 中，circRNA 具有翻譯功能，盡管其翻譯效率非常低. 但是，隨著越來越多核糖體分析數(shù)據(jù)的獲得，circRNA 在其它細胞類型或物種中是否能被翻譯是一個值得深入研究的課題,形成機制,1.“內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化”（intron-pair-driven circularization）模型，2.“套索驅(qū)動環(huán)化”（lariat-driven circularization）模型,Xiao-Ou.Co

8、mplementary Sequence-Mediated Exon Circularization. Cell, September 18, 2014;DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.001,套索驅(qū)動環(huán)化,哈佛醫(yī)學(xué)院 Salmena 等于 2011 年 7 月提出了著名的 ceRNA 調(diào)控假說。 該假說認為： ceRNA 的生物 學(xué) 功 能 是 通 過 miRNA 應(yīng) 答 元 件 （ miRNAresponse

9、 element,MRE） 完成的，ceRNA 具有數(shù)量和種類不等的 MRE,可以競爭性地結(jié)合 miRNA,降低miRNA 對其靶標的抑制作用，也就是 miRNA 的海綿作用。2012年第一篇環(huán)狀RNA文章（Salzman，2012）發(fā)表，Salzman通過RNA-Seq方法首次報道了80個環(huán)狀RNA。至此借助于高通量測序技術(shù)，環(huán)狀RNA(circular RNA)驗明正身進入科研視界，送出了來自這一環(huán)狀宇宙的第一份信函Jeck 等

10、在人類成纖維細胞中檢測出了高達 25000 多種的circRNA；而Memczak等通過RNA-seq 數(shù)據(jù)結(jié)合人白細胞數(shù)據(jù)庫鑒定出 1950種人類circRNA、1903種小鼠circRNA (其中81種與人類circRNA相同) 和724種線蟲circRNA Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.Nature.Year publi

11、shed:(2013)DOI:doi:10.1038/nature119282013年Rajewsky教授曾在Nature上發(fā)表文章指出，circRNA具有microRNA海綿的作用，可以結(jié)合并抑制microRNA的活性，進而調(diào)控microRNA靶標發(fā)揮作用。atural RNA circles function as efficient microRNA sponges.NatureYear published:(2013)DOI:

12、doi:10.1038/nature119932013年9月12日中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所陳玲玲組與計算生物所楊力組合作，在《Molecular Cell》（IF:14.08）上發(fā)表 Circular Intronic Long Noncoding RNAs ；構(gòu)成、細胞定位、成環(huán)機制、功能機理2015年2月的《Nature Structural & Molecular Biology》（IF:13

13、.30）中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)單革實驗室報導(dǎo)了其發(fā)現(xiàn)的一類新型非編碼RNA以及此類非編碼RNA的功能機理 Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus德國Max Delbrück分子醫(yī)學(xué)中心Cell子刊發(fā)布環(huán)狀RNA的表達圖譜為人們提供了一個哺乳動物大腦的circRNA表達圖譜，證明circRNA在大腦中起到了重要的作用，具有成為生物學(xué)指標的價值Ci

14、rcular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expresse2017年3月以來Cell Research、Molecular Cell等雜志接連報道了3篇內(nèi)源性circRNA可以翻譯蛋白質(zhì)的研究,但對翻譯的新蛋白生物學(xué)功能和分子調(diào)控機制仍不清楚。,CircRNA 研究進展,,CirlRNA文章典型案例分析,2017

15、年8月29日，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科張弩副教授團隊在國際頂級學(xué)術(shù)期刊美國國家癌癥研究所雜志JNCI（Journal of the National Cancer Institute，IF2016 = 12.589）發(fā)表題為“Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis”的論文，在國際上首次證實circ-FBXW7可以翻譯一種抑制膠質(zhì)瘤的全新蛋

16、白質(zhì)，并用功能學(xué)實驗證明了新蛋白的分子機制，在腫瘤circRNA研究中具有里程碑意義！,重點關(guān)注以下三點：1、如何篩選和確定目標circRNA分子？2、如何推測和證實circRNA翻譯蛋白質(zhì)？3、如何研究circRNA翻譯蛋白質(zhì)的生物學(xué)機制？,研究思路,,生物信息學(xué)方法：得到下機數(shù)據(jù)后，首先將會對其進行過濾，得到HQ Clean Reads。每個樣品的 HQ Clean Reads利用Botiwe2和TopHat分別與核糖體序列

17、和參考基因組比對，從比對結(jié)果中提取Unmapped Reads，然后截取每一條Unmapped Reads的兩端（默認20bp），得到Anchors Reads。用Anchors Reads再一次比對到基因組上，將得到的比對結(jié)果提交給find_circ軟件鑒定出環(huán)狀RNA。,比對和篩選結(jié)果：總共發(fā)現(xiàn)了31145個circRNAs，其中6442個已經(jīng)收錄在circbase數(shù)據(jù)庫中。大多數(shù)circRNAs（18399個）來源與外顯子區(qū)域，

18、其它來源于內(nèi)含子，5’-UTR, 3’-UTR區(qū)域或者antisense sequences。絕大多數(shù)circRNAs的長度小于1500bp，其中小于500bp的數(shù)量最多。癌和癌旁中circRNAs的染色體分布沒有明顯差異，但是癌組織中circRNA整體表達豐度低于正常組,,,重點關(guān)注以下三點：1、如何篩選和確定目標circRNA分子？2、如何推測和證實circRNA翻譯蛋白質(zhì)？3、如何研究circRNA翻譯蛋白質(zhì)的生物學(xué)機制？,

19、研究思路,,生物信息學(xué)方法：首先，通過上述circRNA深度測序及生物信息學(xué)分析挖掘edgeR ，發(fā)現(xiàn)了一些在腦組織以及癌旁組織中有明顯表達差異的circRNAs。其次，作者關(guān)注了著名的抑癌基因FBXW7基因的第3、4外顯子環(huán)化后形成一個620 nt的環(huán)狀RNA，并命名為circ-FBXW7。最后，作者根據(jù)circRNADb在線數(shù)據(jù)庫檢索了一下，發(fā)現(xiàn)此數(shù)據(jù)庫收錄了FBXW7基因?qū)?yīng)的一個circRNA跨越基因組長度1227bp

20、的分子，剪接的成熟體circRNA是620nt，有一段編碼 185 個氨基酸（amino acid，aa）的開放讀碼框，在物種間高度保守，暗示著circ-FBXW7可能具備蛋白編碼的潛能。綜合以上特點，作者將研究目標鎖定為circ-FBXW7，是整篇文章的基石,,circRNA基因注釋,CircRNA文章典型案例分析,對find circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNA finder和CIRI 五個軟件

21、進行了對比，找出了各個軟件的優(yōu)劣。,對find circ、MapSplice、CIRCexplorer、circRNA finder和CIRI 五個軟件進行了對比，找出了各個軟件的優(yōu)劣。,mapping,比對不上的reads取兩頭20bp 重新比對,篩選條件1. GU/AG 在剪接位點的兩側(cè)出現(xiàn)可以檢測到清晰的breakpoint2. 只支持2個mismatch3. breakpoint不能再短序列（anchor）以里2 nuc

22、leotides 之外的地方出現(xiàn)，也就是最多2nt 4. 至少有兩條reads支持這個junction5.mapping正確的一個短序列的位置要比它mapping到其他位置的分值高35分以上,2. CIRCexplorer這款工具是在2014年隨著 Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization 的發(fā)布而問世，被譽為2014年RNA測序領(lǐng)域最值得一讀的文章之一！2016年

23、新版本CIRCexplorer2,相關(guān)文獻：1. Xiao-Ou Zhang,Hai-Bin Wang,and Zhang,Xuhua Lu,Ling-Ling Chen,and Li Yang Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization2.Zhang, X.O., Dong, R., Zhang, Y., Zhang, J.L., Luo, Z., Zhang, J

24、., Chen, L.L., and Yang, L. (2016). Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Res.CIRCpedia網(wǎng)址：http://www.picb.ac.cn/rnomics/circpedia,設(shè)計原理：CIRCexplorer這個工具巧妙的用fusion

25、gene這個思路去檢測circRNA。,,2. CIRCexplorer這款工具是在2014年隨著 Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization 的發(fā)布而問世，被譽為2014年RNA測序領(lǐng)域最值得一讀的文章之一！2016年新版本CIRCexplorer2,CIRCexplorer2繼承了CIRCexplorer主要功能并增加了很多新的特性。它支持TopHat2/TopHat

26、-Fusion, STAR, MapSplice, BWA and segemehl等多種RNA aligners, 并且能夠精確地注釋預(yù)測到環(huán)狀RNA。更為重要的是，該工具可以偵測到多種環(huán)狀RNA可變剪切事件，并且能夠de nove組裝環(huán)狀RNA全長轉(zhuǎn)錄本,CircRNA目前生物信息分析流程比較,建庫測序生物信息分析,建庫,Novogene circRNA建庫測序策略,鏈特異性建庫？,建庫,數(shù)據(jù)量,,分析流程,Novogene c