酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用

1、第四節(jié) 酶免疫分析技術(shù)在生物藥物分析中的應(yīng)用,其應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：藥物含量（活性）測(cè)定宿主蛋白殘留檢測(cè)抗生素殘留檢測(cè)雜質(zhì)檢測(cè)污染物檢測(cè)藥物原材料檢測(cè)藥物摻假檢測(cè),一、GLP-1活性檢測(cè),Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) ELISA Kit,GLP-1,GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強(qiáng)的腸肽類激素，它通過與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合發(fā)揮作用 1）G

2、LP-1可通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空來降低血糖 2）GLP-1還有減緩β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其再生的獨(dú)特作用 3）GLP-1還能減慢胃排空速度，通過作用下丘腦，抑制食欲。,GLP-1結(jié)合GLP-1R后，激活細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰島成熟β細(xì)胞的GLP-1受體偶聯(lián)Gs，活化腺苷酰環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，后者與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉(zhuǎn)錄和

3、胰島素原生物合成，可降低胰高血糖素濃度并抑制胰高血糖素分泌，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐后血糖濃度。,報(bào)告基因檢測(cè)原理,試驗(yàn)原理,采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被cAMP特異性抗體，樣品中cAMP將和標(biāo)準(zhǔn)HRP-cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔條上cAMP特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中cAMP的含量成負(fù)相關(guān)。以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對(duì)照品和供試品的量效曲線

4、，得出半效量濃度，求得供試品相對(duì)生物活性。,操作程序：,1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/孔，室溫1 h;2、洗滌后，向不同孔中分別cAMP、對(duì)照或細(xì)胞裂解上清品（樣品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50 ul/孔，室溫作用2h；4、洗滌后，向孔中加入TMB溶液， 200 ul/孔，室溫作用30min；5、向孔中加入終止液，100 ul/孔，測(cè)定OD450nm/570nm,數(shù)據(jù)與結(jié)果,1. 標(biāo)

5、準(zhǔn)曲線的繪制：（1）測(cè)定各濃度梯度下各孔對(duì)照品和供試品相應(yīng)的吸光值，并分別計(jì)算平均值；（2）以吸光值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，按四參數(shù)法回歸擬合對(duì)照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度；對(duì)照品EC50；測(cè)試樣EC502. 數(shù)據(jù)處理： 供試品相對(duì)生物活性（%）=對(duì)照品EC50/供試品EC50?100% 其中：對(duì)照品和供試品的EC50分別表示對(duì)照品和測(cè)試樣的半效量的濃度。四參數(shù)方程中的C值即相當(dāng)于半效量的濃度(EC50)。

6、,典型的測(cè)定結(jié)果及回歸曲線,二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測(cè),Cygnus  F550 CHO HCP ELISA Kit,宿主細(xì)胞蛋白污染物,CHO宿主蛋白殘留  E-coli宿主蛋白殘留  酵母菌宿主蛋白殘留  HEK293宿主蛋白殘留,2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細(xì)胞系的全蛋白譜將2D Gel上的全蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，用多克隆抗體孵育后

7、進(jìn)行Western Blot化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，以確認(rèn)多克隆抗體能夠與哪些宿主細(xì)胞蛋白結(jié)合通過Western Blot檢測(cè)結(jié)果（多抗能檢測(cè)到的HCP數(shù)量）與2D膜上檢測(cè)結(jié)果（總HCP數(shù)量）的比較，得出用于評(píng)價(jià)檢測(cè)的多克隆抗體特異性及適用性的Match Rate,評(píng)估HCP定量用多克隆抗體的特異性,試驗(yàn)原理,采用雙位點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗CHO CHP多抗，免疫反應(yīng)構(gòu)成為夾層式結(jié)構(gòu)：固相抗體-HCP-酶標(biāo)記抗體。反應(yīng)結(jié)束后

8、清洗酶標(biāo)板去除未結(jié)合反應(yīng)物，添加TMB底物顯色，吸光值與樣品中CHO宿主蛋白的含量成正相關(guān)。,檢測(cè)步驟：,（1）于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 μL抗CHO HCP多抗-HRP；（2）從標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、對(duì)照和樣品中吸取50 μL 上清加入到已標(biāo)記好的反應(yīng)孔中；180rpm下室溫、振蕩培養(yǎng)2h；（3）棄去孔內(nèi)溶液，每孔加350 μL 洗滌液，重復(fù)洗滌4次；（4） 于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 μL TMB底物溶液，于室溫孵育30mi

9、n；（5 ）于每個(gè)反應(yīng)孔中，加入100 μL終止液；依序讀取OD450/650 nm吸收值(空白對(duì)照孔調(diào)零)。（6）數(shù)據(jù)處理：根據(jù)測(cè)定每孔標(biāo)準(zhǔn)液吸光值繪制四參數(shù)邏輯曲線，然后根據(jù)樣品吸光值計(jì)算出樣品中HCP濃度。,ELISA法研究藥物作用靶點(diǎn)（GPⅡb/Ⅲa受體）,實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)原理，先在96孔板上包被纖維蛋白原，然后同時(shí)加入GPIIb/IIIa受體和待測(cè)樣品，再加酶標(biāo)抗體與GPIIb/IIIa受體結(jié)合，最后

10、加入底物，酶作用于底物顯色，在405nm測(cè)得OD值，OD值與GPIIb/IIIa受體量成正比。如果樣品與GPIIb/IIIa 受體結(jié)合，就會(huì)降低纖維蛋白原與受體的結(jié)合，導(dǎo)致所測(cè)的OD值降低。,實(shí)驗(yàn)步驟： 首先將纖維蛋白原（10 μg/ml）用buffer A（0.1 M Na2CO3, PH 9.5）包被于96孔板上（100 μl/well）（空白對(duì)照: 不包被纖維蛋白原），4°C孵育過夜；TACTS（0.02M Tris

11、- HCl, PH 7.5，0.15M NaCl，1mM CaCl2,0.02% NaN3,0.05% Tween 20）沖洗一次，每孔200μl，3min；用含1% BSA 的TACTS 在37°C封閉1h（200 μl/well）,TACTS洗三次；整合素αIIbβ3（20 μg/ml、50 μL/well）加一定濃度的待測(cè)樣品50 μl作為樣品組；加孵育液做陰性對(duì)照組；37°C下孵育2h；TACTS 洗三次

12、；加一抗（鼠抗人CD61抗體，含0.5%BSA ,TACTS稀釋，1:2000(體積比)，100μL /孔）37°C下孵育1h；,,TACTS 洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA ,TACTS稀釋，1:1000，100μL /孔），37°C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液(PNPP)1mg/ml，用buffer B溶解，200μL/well），37℃下孵育30

13、min；加入50μL 3M NaOH(稱0.6g加5ml蒸餾水)終止反應(yīng)；5min內(nèi)405nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。,,數(shù)據(jù)處理通過以下公式計(jì)算抑制率：[(X?Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理鹽水組OD值；Y代表樣品組OD值；Z代表空白對(duì)照組OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析。p<0.05界定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)處理均使用GraphPad Pris

14、m 6軟件(GraphPad Software，美國(guó))。,溶液配制及注意事項(xiàng)（60 well大概用量）1. buffer A：0.1M Na2CO3 50ml：取固體0.53g溶液50ml蒸餾水中，調(diào)PH 9.5.2. TACTS洗脫液（需300ml）：定容100ml，pH 7.5， Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween 20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（5

15、0ml）：TACTS加0.5%BSA封閉液（20ml）：TACTS加1%BSA3. 受體αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受體使用的終濃度為20μg/ml。4. 一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005. 樣品配制：不溶的樣品加DMSO全溶，終濃度不超0.5%6. 受體，抗體，樣品均用孵育液稀釋。,,7. buffer B（底物緩沖液）：定容100ml，PH 9.5, 二乙醇胺：105μl

16、；MgCl2：10.175mg8. PNPP對(duì)光敏感，現(xiàn)配現(xiàn)用，用buffer B溶解9. 配制的纖維蛋白原濃度越高儲(chǔ)存越穩(wěn)定，37℃水浴鍋加熱包被液溶解，儲(chǔ)存Fg>1mg/ml時(shí)較穩(wěn)定。,三、卡那霉素殘留檢測(cè),卡那霉素檢測(cè)試劑盒,2015年版藥典凡例十六：（3）生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能避免使用抗生素，必須使用時(shí)，應(yīng)選擇安全性風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低抗生素，使用抗生素種類不得超過1種，且產(chǎn)品后繼工藝應(yīng)保證可有效去除制品中抗生素，去除工藝應(yīng)該驗(yàn)

17、證。（4）生產(chǎn)過程中使用抗生素時(shí)，成品鑒定中應(yīng)檢測(cè)抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限制。上述的生產(chǎn)過程包括種子培養(yǎng)活化，發(fā)酵，純化等所有的步驟，所以種子活化階段是算在生產(chǎn)過程中的。,試驗(yàn)原理,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣

18、品中卡那霉素的含量。,操作步驟,1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。,5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml 到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)二抗50ml/孔，再

19、加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)40min。6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應(yīng)15min。8、測(cè)定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/

20、630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。,定量分析,（1）百分吸光率的計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即 百分吸光度值（%）＝B/B0×100% B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

21、 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實(shí)際殘留量。,卡那霉素測(cè)定方法驗(yàn)證,檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線,,競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定藥盒卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品,卡那霉素在樣品溶液中的回收率,卡那霉素在樣品稀釋液中的回收率(n=6),精密度試驗(yàn),卡那霉素稀釋樣本競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分析精

22、密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6),四、人胰島素原殘留檢測(cè),Mercodia Proinsulin ELISA kit,目前重組人胰島素生產(chǎn)主要以E.coli表達(dá)人胰島素原，初步純化后變復(fù)性，經(jīng)胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)協(xié)同酶切，去掉前導(dǎo)肽和C-肽，形成有活性的胰島素，并進(jìn)一步純化精制而成。上述工藝制備所得人胰島素產(chǎn)品中可能殘留人胰島素原、C-肽等人胰島素相關(guān)雜質(zhì)，其殘留的存在可能影響人胰島素的

23、藥效。,Insulin conversion formation process and structure diagram,試驗(yàn)原理,采用雙單抗夾心ELISA法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被抗胰島素原C-肽特異性抗體，樣品中胰島素原結(jié)合微孔條上的特異性抗體，然后加入HRP標(biāo)記的抗胰島素特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中胰島素原的含量成正相關(guān)。,操作步驟,1、加樣：加待檢樣品，100 μl/孔，37℃ 2 h，同上洗滌；2、加酶標(biāo)

24、抗體：酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋HRP-13A4至工作濃度，100 μl/孔，37℃ 1h，同上洗滌；3、顯色和中止反應(yīng)：加新鮮配制的底物100μl/孔，37℃避光作用20 min；加中止液50μl/孔終止反應(yīng)，測(cè)定每孔OD450/630nm值。4、數(shù)據(jù)處理：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)log(c)對(duì)吸光值 log(y)回歸，可求得樣品中人胰島素原的殘留量。,,Standard curve for rhPI in PBS was determined