藥品分析方法建立及驗證——從質量控制出發(fā)

1、藥品分析方法建立及驗證——從質量控制出發(fā),,2016.03.23,,,健康元生物醫(yī)藥有限公司,目錄,方法考慮原則,預期的監(jiān)督機構期望產品質量參數對安全性和有效性的預期影響分子的具體開發(fā)經驗來自之前以開發(fā)的類似分子的平臺經驗,方法開發(fā)考慮,折疊結構可以防止生物制品降解，但同時使分子的某些部分難以被檢測到被結構所保護的易受影響基團延緩了降解過程（氧化、脫酰胺基、切斷和聚合）完整結構使得分析方法很難檢測到內部的變化在某些分析中保

2、持三維結構是很重要的（如SEC），但在其他一些分析中則需拆開折疊結構（如變性凝膠電泳）,方法開發(fā)考慮,如何解釋不是針對完整分子而是針對裂解部分所進行的檢測而獲得的數據有時有必要將一個蛋白分子裂解為所需的片段，然后對所關注的片段進行分析，如用于蛋氨酸氧化測定肽圖多數時候片段并非以簡單直接或線性的方式與完整分子相關聯（不再是1：1）需要明確地確定完整分子的片段進行分析而得到的某些參數的報告值,方法開發(fā)考慮,從不同正交試驗或從主要和輔助

3、試驗所得的雜質量并不是可以累加的生物制品需要多項檢測來檢量其多種特性，如電荷、分子大小等如果一個分子包含多種修飾，則它將被多次計算，但是降解的分子仍然只有一個所以不同檢測所得到的值是不能累加的,方法開發(fā)考慮,對于所要分析的蛋白質物種，通常無法獲得純的樣品用來進行加樣/回收的物質是所要分析的蛋白質物種（雜質）的富集物，而不是純化物,很多時候，峰并不能達到基線分離可容許實驗誤差較大定量限較高,方法開發(fā)考慮,基質（配方組成）或酸堿

4、度變化、自由巰基的出現等，可能在分析過程中形成原來并不存在的雜質通過溶液交換消除基質影響減少暴露于過高或過低酸堿度溶液的時間在某些特定方法中，自由巰基會導致分析方法造成的雜質這些都是要設法避免,方法開發(fā)考慮,1. 生物學活性：是反映生物技術藥物質量的重要指標，通常使用細胞或動物進行測定，誤差相對較大。不同批細胞、血清、或其它易變性物質對測定方法的準確度和精密性均有影響。2. 生物技術藥物多為生物大分子藥物，具有分子量大、結構多

5、樣性和可變性等特點，結構的細微變化可影響藥物的活性和質量。3. 對酸、堿、高溫、凍融等不穩(wěn)定，保存、運輸條件不當會影響藥品質量，并可能導致方法轉移困難或失敗。4. 標準物質：活性標準品、含量標準品、理化對照品，根據情況可能分別制備，保存、運輸條件相對較高，需對其穩(wěn)定性進行認真分析與評價。,方法哪里來,標準方法（或正式方法、法定方法） 一般是指已有國家標準的質控方法，WHO 推薦的質控方法也可作為重要參考。此類方法在被確定為標準方法

6、前已經過了適當的驗證。申報者應說明方法的來源，并附具體方法。研制單位在首次采用此類方法前，也應對該方法進行適當的驗證，如進行專屬性和精密度的驗證，以便證明在實際的使用條件下該方法也是適用的。 標準方法的替代方法 此類方法系指由申報者提出的可取代標準方法的替代方法。申報者在決定采用此類方法時應持慎重的態(tài)度，并需提供表明新方法等同于或優(yōu)于原方法的依據以及全面的驗證資料，包括兩種方法的比較性資料。,來自參考文獻的方法 是指在專業(yè)雜志或著

7、作上發(fā)表并介紹的方法，一般要認真對待此類方法，并需進行全面的驗證。應說明參考文獻的出處，附原文及譯文。 自己建立的方法 對于某些產品，尤其是創(chuàng)新性產品來講，由于缺少可參考的方法，通常需要自己建立一種新的分析方法，對于這類方法需進行全面而嚴格的驗證。,開發(fā)什么方法,適用于所有分子的方法蛋白濃度或含量紫外/可見光光度法（基于消光系數，靈敏度低，干擾物多）高效液相色譜法（基于標準樣校正）BCA/TCA/G250（基于標準樣校正，基

8、質有可能干擾)電荷概括離子交換色譜（原始狀態(tài)）毛細管等電聚焦法（原始狀態(tài)和局部變性狀態(tài)）,開發(fā)什么方法,適用于所有分子的方法分子大小概況SEC（原始狀態(tài)）凝膠電泳法（非折疊（變性）狀態(tài)）病毒樣顆粒概況電鏡（局部原始狀態(tài)，人為影響因素大）DLS（原始狀態(tài)，分辨率差，大小精準）SEC（原始狀態(tài)，流動相會影響蛋白狀態(tài)）,開發(fā)什么方法,適用于所有分子的方法雜質殘留量HPLC（基于標準樣校正或自身對照）GC（對殘留溶劑）

9、ICP/AAS （對元素測定）Elisa （宿主蛋白、雜蛋白測定）Southern Blot/熒光光譜 （殘留DNA）,開發(fā)什么方法,適用于特定分子的方法分子鑒定肽圖 （純度較高）Western Blot （使用范圍廣）紫外掃描圖 （純度及基質要求高）氨基酸測序 (純度及基質要求高，樣品末端無封閉）偶聯密度ADC （抗體藥物偶聯物）抗原與載體蛋白偶聯物（疫苗類藥物）結合力 抗原與佐劑相互作用,開發(fā)什么方法,適用于

10、特定分子的方法活性測定Elisa（體外評價）動物實驗 （體內評價）中和實驗 （細胞測定特定表位）降解物測定HPLC/MS（基于標準樣校正或自身對照）凝膠電泳 （基于特異分子帶）SEC/熒光光譜 （解聚或聚合）,開發(fā)什么方法,檢測方法初識——電泳及毛細管電泳,檢測方法初識——SEC,檢測方法初識——DAD光譜,檢測方法初識——熒光光譜,檢測方法初識——HPLC肽圖,,,檢測方法初識——UV Cp-Temp,檢測方法初識——

11、HPLC肽圖,睫狀神經營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF),檢測方法初識——ESI-MS,分析方法驗證——法規(guī)要求,,資料6.質量研究資料，臨床前有效性及安全性研究資料（1）質量研究及注冊標準研究資料；（2）檢定方法的研究以及驗證資料；（3）與同類制品比較研究資料；（4）產品抗原性、免疫原性和動物試驗保護性的分析資料；（5）動物過敏試驗研究資料；（6）動物安全性評價資料。,,分析方法驗

12、證——法規(guī)要求,,1.6探索性研究及其檢驗結果分析1.6.1開展探索性研究項目及其目的。敘述開展探索性研究的項目，研究目的，采用的主要方法。1.6.2探索性研究及其檢驗結果分析。逐項敘述探索性研究項目詳細研究方法，樣品與對照品的典型圖譜或照片，研究結果與結論。該項目的方法學按中國藥典附錄驗證，詳細方法學驗證內容在附件中列出。,,分析方法驗證——法規(guī)要求,,,,分析方法驗證——法規(guī)要求,,,分析方法驗證——法規(guī)要求,第十二條 質量控

13、制的基本要求： （四）檢驗方法應當經過驗證或確認；,第二百二十三條 物料和不同生產階段產品的檢驗應當至少符合以下要求： （二）符合下列情形之一的，應當對檢驗方法進行驗證： 1.采用新的檢驗方法； 2.檢驗方法需變更的； 3.采用《中華人民共和國藥典》及其他法定標準未收載的檢驗方法； 4.法規(guī)規(guī)定的其他需要驗證的檢驗方法。（三）對不需要進行驗證的檢驗方法，企業(yè)應當對檢驗方法進行確認，以確保檢驗數據準確、可靠；,,分析方法驗證

14、——驗證項目,限度、鑒定等定性或半定量試驗，無標準曲線，不作精密度、準確度要求。,分析方法驗證——驗證項目,I類方法：制劑中原料藥或活性成分（包括防腐劑）的定量分析方法；II類方法：原料藥中雜質或制劑中降解化合物的分析方法；包括定量方法和限度檢查；III類方法：藥物性能特征分析方法：溶出，藥物釋放IV類方法：鑒別實驗,分析方法驗證——驗證項目,定義：指一種方法在有可能的干擾物質（如雜質、降解產物和基質）存在時，能夠準確無誤地評估被

15、分析物的能力,分析方法驗證——專屬性,鑒別:確?？梢澡b別被分析物純度檢查：確保所有的分析過程能夠為雜質的含量提供準確的數據，如相關物質檢查、重金屬限度檢查、有機揮發(fā)性雜質檢查等含量測定：提供準確的檢測結果以保證含量樣品中被分析物的含量或效價值準確無誤,在其他成分（雜質、降解產物、輔料等）存在下，采用的分析方法能夠正確測定被測物的能力。作為分析方法的成立基礎。,一般采用相似物、不含API空白樣品作為陰性對照，以標準品或經認可樣品作為陽

16、性對照。,如采用免疫印跡試驗進行生物制品的鑒別，應首先對所使用抗體的特異性進行分析；若供試品中還存在其它組分，則應進一步驗證被檢測物中其它物質能否引起非特異性免疫反應。,例如：,如采用細胞測定方法檢測生物活性，應首先說明被測物質與特定的細胞應答之間的相關性，如二者的相關性較好，則一般認為該方法的特異性較好。為表明細胞測定方法的特異性，可進行相關試驗進行驗證，如加入抗體或特異抑制劑的封閉實驗等。如果成品中加入了可能影響活性測定的輔料，應進

17、行相關驗證以排除此種影響。,如采用ELISA法檢測重組產品的殘余宿主蛋白含量，可采用與表達體系相同的宿主細胞的蛋白作為免疫原制備抗體，若采用與產品相似工藝進行處理后再免疫動物，則所獲得抗體的特異性更好。另外，產品中存在的大量目的蛋白可能影響殘余宿主蛋白的測定，應進行相關驗證以排除此種影響。,分析方法驗證——專屬性,定性分析（鑒別）：樣品陽性結果＋空白陰性結果＋結構相似物質的陰性結果；,分析方法驗證——專屬性,雜質檢查（對照品可得）：將可

18、能的雜質對照品加入樣品中；雜質檢查（對照品不可得）：用另外一種官方的標準或經驗證的方法對樣品和經降解的樣品分析，比較兩種方法得到的雜質概況使用其他技術對峰純度進行檢查，如二極管陣列檢測器、MS等,含量測定：被分析物與其他干擾峰完成分離。向樣品中加入一定量的干擾物，含量測定的結果不受干擾；檢查主峰的純度,鑒別：采用與被測物結構類似的化合物以及被測物分別進行鑒別試驗。被測物為正反應。被測物結構類似的化合物為負反應。測物結構類似的化合物

19、可選用中間體、副產物或降解產物等。,定義：對均一樣品重復取樣檢測每個檢測結果間的接近程度，RSD%,CV%,分析方法驗證——精密度,重復性repeatability：短時間內同一分析人員使用同一儀器中間精密度intermediate precision:在同一實驗室內的變化，如不同分析時間、不同分析人員、不同分析儀器重現性reproducibility:在不同實驗室內重復,方法100％濃度≥6次3濃度×3次,定義：方法

20、的檢測結果與真實值的接近程度。,分析方法驗證——準確度,－方法：原料藥：分析已知含量的對照品；第二種確定的方法分析，結果比較制劑：加樣回收；第二種確定的方法分析，結果比較應在方法的范圍內計算回收率：3濃度×3次,分析方法驗證——精密度與準確度,定義：在聲明的實驗條件下所能檢測到的被分析物的最小量。限度檢查的指標；表示為在樣品中的濃度％, ppm,分析方法驗證——檢測限,方法：檢測已知濃度的樣品(對照品)雜質的DL&

21、lt;0.05%信噪比2:1/3:1,分析方法驗證——定量限,定義：在聲明的實驗條件下被分析物可被定量分析并能滿足合格的精密度和準確度的最小值。微量物質的定量分析：有關物質定量分析，有機揮發(fā)性物質的定量分析。％，ppm,方法：已知濃度樣品（對照品）相關物質<0.05％證明精密度和準確度信噪比10:1,分析方法驗證——標準曲線及線性范圍,標準曲線：一定濃度范圍內，儀器對分析物的響應，可通過一定濃度的分析物（或內標物）與被分

22、析物比較，計算其含量。,基質應盡可能保持與樣品一致，但不應參與樣品前處理工序。因為樣品前處理工序中，可能有不同程度的損失。,若在任何轉換后均不能證明呈線性，或呈線性關系的范圍較小，可以采用曲線擬合方法，通過測定全范圍曲線，在標準品或參考品的矯正下，依ED50或IC50值計算活性單位。應提供擬合曲線方程及各參數，并提供相關系數。,線性范圍：在適當的精密度、準確度和線性基礎上檢測到的被分析物的最低水平到最高水平區(qū)間,分析方法驗證——標準曲線

23、及線性范圍,一定范圍內的不同濃度點進樣，繪制響應值（y）與濃度(x)之間的回歸線，計算回歸方程，相關系數（r,r2）,主成分含量測定：80％－120％檢測濃度雜質含量測定：定量限（50％）－120％標準裝量差異：70％－130％檢測值溶出實驗：±20％規(guī)定范圍,分析方法驗證——標準曲線,樣品吸收值為：1.314,測定值為：869.3μg/ml,若標準曲線處理后，出現2%的損耗，則 測定值為：910.6μg/ml,

24、測定值為：4.75%,分析方法驗證——耐用性,定義：分析方法的某些參數發(fā)生微小變化時方法抗干擾的能力，表示在正常使用時的可靠性,方法：刻意改變參數，考察結果的變化流動相的pH值、流動相的組成（極性的變化）、不同供應商柱子、柱溫、流速等,液相：評估柱溫、流速、色譜柱、緩沖鹽pH、有機相比例、流動相比例、溶液放置時間對檢測結果的影響氣相：評估柱溫、流速、色譜柱、溶液放置時間對檢測結果的影響,分析方法驗證——SEC,基本要求確定無標準

25、品，假設單體、聚合物或VLP在214nm/280nm響應因子基本相同，以峰面積百分比代表重量百分比有標準品，進標準品，測定各自響應因子，以校正峰面積百分比代表重量百分比對于蛋白樣品而言，214nm肽鍵特異波長段響應值高，280nm為蛋白特異波長段響應值低。通常以280nm作為檢測波長。要求能夠對樣品不同聚集、結合狀態(tài)進行分離。,分析方法驗證——SEC,系統精密度將加入了5%聚合物的單個樣品連續(xù)進樣6次，計算6次進樣的聚合物峰面積

26、的相對標準偏差(RSD)值,方法精密度和中間精密度 使用分別由兩位分析人員制備的加入了濃度為2.5%、5.0% 和7.5%聚合物的各三份重復樣品(總共18份配制液)方法精密度是三份重復樣品的最大相對標準偏差(RSD)值中間精密度是所有樣品的相對標準偏差(RSD)值,分析方法驗證——SEC,線性及范圍使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5% 和9.0%聚合物的樣品計算聚合物%與聚合物峰面積的線性回歸,準確度

27、使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5% 和9.0%聚合物的樣品根據高純度單體樣品中的單體和聚合物含量、聚合物富集樣品中的單體和聚合物含量以及加樣中所用的體積來計算加樣樣品中的理論預期聚合物含量,分析方法驗證——SEC,紅線：藥源； 藍線：空白；黑線： 稀釋液,專屬性,分析方法驗證——SEC,驗證數據,分析方法驗證——報告部分,第二百二十三條 物料和不同生產階段產品的檢驗應當至少符合以下要求（六）檢驗記錄應

28、當至少包括以下內容1.產品或物料的名稱、劑型、規(guī)格、批號或供貨批號，必要時注明供應商和生產商（如不同）的名稱或來源；2.依據的質量標準和檢驗操作規(guī)程；3.檢驗所用的儀器或設備的型號和編號；4.檢驗所用的試液和培養(yǎng)基的配制批號、對照品或標準品的來源和批號；5.檢驗所用動物的相關信息；6.檢驗過程，包括對照品溶液的配制、各項具體的檢驗操作、必要的環(huán)境溫濕度；7.檢驗結果，包括觀察情況、計算和圖譜或曲線圖，以及依據的檢驗報告編號

29、；8.檢驗日期；9.檢驗人員的簽名和日期；10.檢驗、計算復核人員的簽名和日期。（七）所有中間控制（包括生產人員所進行的中間控制），均應當按照經質量管理部門批準的方法進行，檢驗應當有記錄；（八）應當對實驗室容量分析用玻璃儀器、試劑、試液、對照品以及培養(yǎng)基進行質量檢查；,分析方法確認——適用范圍,適用于藥典方法和其他已驗證的法定標準。因為藥典方法和其他法定標準被認為是驗證過的分析方法，不需要驗證，但需要通過方法確認來證明方法在該

30、實驗室條件下的適應性。,分析方法確認——操作方式,對于方法確認，通常采用兩種方式：一、由兩名檢驗人員分別獨立對同一批產品進行檢驗（如可能使用不同的儀器）比較兩人的檢測結果來證明方法在本實驗室（人員，分析儀器，試劑）的適用性；二、根據驗證目的和評估結果選擇相關項目進行確認：（具體見下表）,-表示該項內容不需要確認；+表示該項內容需要確認；±表示該項內容視情況評估是否需要確認,分析方法再驗證,在某些情況下，如原料藥合成工藝改變

31、、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行部分或完整的再驗證，以保證分析方法可靠,當原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質，雜質檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質檢查方法能夠檢測新引入的雜質，且新引入的雜質對主成份的含量測定應無干擾。,當制劑的處方組成改變、輔料變更時，可能會影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，因此需要對鑒別、含量測定方法再驗證。當原料藥產地來源發(fā)生變更時，

32、可能會影響雜質檢查和含量測定的專屬性和準確度，因此需要對雜質檢查方法和含量測定方法進行再驗證。,再驗證原則：根據改變的程度進行相應的再驗證。 當這種改變到達一定程度時，則需要完整的驗證。如分析方法完全改變時，則應視為新方法并需要完整的驗證。方法再驗證是對分析方法的完善過程，應根據實際改變情況進行再驗證，從而保證所采用的分析方法能夠控制藥品的內在質量。,推薦,http://www.cfdi.org.cn/cfdi/mOpen?fid=op