生物學(xué)的幾個(gè)階段

1、一、生物學(xué)的幾個(gè)發(fā)展階段簡要回顧,二、分子生物學(xué)的發(fā)展簡史,三、分子生物學(xué)的概念、原理、研究內(nèi)容,四、分子生物學(xué)取得的主要理論成就,五、分子生物學(xué)取得的重要應(yīng)用成就,六、分子生物學(xué)的主要技術(shù)進(jìn)步七、遺傳的分子生物學(xué)八、基因工程,現(xiàn)代生物學(xué)進(jìn)展,1、普通生物學(xué)階段：以個(gè)體、群體、博物、描述為特 征的生物學(xué),,,2、細(xì)胞生物學(xué)階段：在細(xì)胞水平上揭示生命活動(dòng)規(guī)律,

2、3、分子生物學(xué)階段：在生物大分子水平上研究生命活 動(dòng)規(guī)律,,4、反向生物學(xué)階段: 由基因型到表型，由序列到功能 的，與傳統(tǒng)生物學(xué)研究思路反向 而行的生物學(xué)，從理論上探討生

3、 命的本質(zhì)和生命運(yùn)動(dòng)的邏輯。,一、生物學(xué)的幾個(gè)發(fā)展階段,二、分子生物學(xué)發(fā)展簡史,1944. Avery證明DNA為遺傳物質(zhì)（轉(zhuǎn)化試驗(yàn)）1953. Waston&Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1958. Crick提出遺傳中心法則1961. Monas&Jacob 乳糖操縱子模型1966. Neriberg等 破譯全部遺傳密碼1970. Arber等 DNA限制性內(nèi)切酶

4、 Khorana 體外合成tRNA，發(fā)現(xiàn)連接酶 Baltimore&Temin 逆轉(zhuǎn)錄酶,1972. Berg λ噬菌體與SV40DNA體外重組1973. Boyer&Cohen 重組質(zhì)粒表達(dá)成功1975. Southern 發(fā)明雜交技術(shù) Bishop等發(fā)現(xiàn)第一個(gè)癌基因Src1977. Sanger.Maxman&Gilbert 快速測序1978.

5、Miniatis 建立人類基因文庫1981. Cech&Altman 發(fā)現(xiàn)核酶1983. McClintock 發(fā)現(xiàn)的跳躍基因獲獎(jiǎng)1984. Kohler 單克隆抗體技術(shù)1985. Mullis 首創(chuàng)PCR技術(shù),1990. 人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)1993. Roberts&Sharp 發(fā)現(xiàn)斷裂基因 Smith進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變1994. Gilman&Bodbell G蛋白信號轉(zhuǎn)

6、導(dǎo)1995. Lewis等發(fā)現(xiàn)果蠅體節(jié)發(fā)育基因1997. Stanley 發(fā)現(xiàn)朊病毒1999. Gunter.Blobel 闡明胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸機(jī)理2000. Carlsson等神經(jīng)多巴胺在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用2001. Hartwell等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK激酶等,三、分子生物學(xué)概念、原理、內(nèi)容,1、概念： 廣義：所有生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、重要性、規(guī)律性及相互關(guān)系 狹義：分子遺傳學(xué),2、內(nèi)容：①生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能

7、 或 ①蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)②基因工程 ②核酸的分子生物學(xué)③基因表達(dá)調(diào)控 ③信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué),3、三條基本原理： ①所有生物體大分子的構(gòu)成單位相同②大分子建成規(guī)則相同③生物體的特異性由其大分子的特異性所規(guī)定,四、主要的理論成就,1、DN

8、A雙螺旋模板學(xué)說2、遺傳中心法則3、基因表達(dá)調(diào)控理論 （操縱子模型）4、基因?qū)W說的豐富和發(fā)展 （基因現(xiàn)代概念的確立）5、基因突變理論6、基因作圖理論7、分子進(jìn)化學(xué)說8、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說,9、細(xì)胞周期調(diào)控理論10、癌變的分子機(jī)制11、通用遺傳密碼字典與 非通用遺傳密碼字典12、生物信息學(xué)13、基因組學(xué)與比較基因 組學(xué)14、“RNA世界”假說15、細(xì)胞衰老和程序化死

9、 亡機(jī)理,五、主要的應(yīng)用成就,（1）已用基因工程的技術(shù)研制出了一批珍貴的基因工程藥物： ①人生長抑素 ②生產(chǎn)胰島素 ③生產(chǎn)生長激素 ④生產(chǎn)組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子 ⑤抗血友病因子Ⅳ ⑥制備乙型肝炎疫苗 ⑦生產(chǎn)多種細(xì)胞因子 ⑧制備基因工程抗體,1、在醫(yī)學(xué)

10、上的應(yīng)用成就,,（2）基因診斷與基因治療 ① 疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異 性高，適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，常用方法有核酸雜交、RFLP、 PCR、DNA指紋圖譜 ② 法醫(yī)診斷、親子鑒定 ③ 基因治療：方法有將目的基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒重組、轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞，使之表達(dá)以彌補(bǔ)缺陷；將目的基

11、因?qū)θ旧w 進(jìn)行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,至1997年，美國已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物有近20種，它們是：胰島素、人生長激素、干擾素、白細(xì)胞介素2、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、組織溶纖原激活劑、生長激素、促生長素、抗血友病因子Ⅷ、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、體內(nèi)用單克隆抗體、鼠單克隆抗體。 至1998年，我國已批

12、準(zhǔn)上市的基因工程藥物亦有10余種，如：干擾素、白細(xì)胞介素、粒細(xì)胞集落刺激因子、鏈激酶、紅細(xì)胞生成素、成纖維細(xì)胞生長因子等。,基因工程方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的優(yōu)勢是非常明顯的,已投入使用（含臨床試驗(yàn)）的基因工程疫苗,,①轉(zhuǎn)基因植物：已克隆了100多個(gè)植物基因，使作物獲得高 產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗蟲、抗逆等多種優(yōu)良性狀，下表列出 了各國轉(zhuǎn)基因作物的大田釋放情況：,2、在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用成就,我國獲準(zhǔn)進(jìn)入大田的轉(zhuǎn)基因植物（1998）,②轉(zhuǎn)基

13、因動(dòng)物：相繼培育成功的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括，鼠、豬、 羊、雞、兔、鯉魚、鯰魚、金魚等。,③克隆動(dòng)物：1997年，英國科學(xué)家克隆成功“多莉”綿羊 （由成年乳腺細(xì)胞發(fā)育而來）和“波莉”綿羊，它的乳汁 中含有人類基因的蛋白產(chǎn)物。,④分子輔助育種：改選育性狀為選育標(biāo)記。,.,3、在能源開發(fā)和環(huán)保中的成就,①利用超級工程菌以植物秸桿作材料生產(chǎn)有 “綠色石油”之稱的新型能源——酒精。②構(gòu)建超級工程菌迅速清除海洋中的石油污

14、 染及其它環(huán)境污染。,4、在采礦工業(yè)中的應(yīng)用,用工程菌浸礦，浸出銅、鈾、鈷、錳、鋅、鋁等金屬加拿大用細(xì)菌浸出的鈾已達(dá)230萬噸。,,,①人類基因組計(jì)劃②水稻基因組計(jì)劃③模式生物基因組研究：已闡明基因組序列的生物有19種 （均為單細(xì)胞生物），此外小鼠、果蠅、家蠶、擬南芥等 模式生物的基因組序列也將很快闡明。④建立了世界共享的三大分子數(shù)據(jù)庫,5、基因組學(xué)的重大進(jìn)展,六、技術(shù)進(jìn)步,1.超離技術(shù)2.電泳技術(shù)3.電鏡

15、技術(shù)4.X衍射與核磁共振5.分子雜交技術(shù)(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文庫7.PCR,8.DNA測序9.DNA化學(xué)合成10.載體構(gòu)建11.染色體步查12.基因定點(diǎn)誘變13.基因打靶14.基因轉(zhuǎn)移15.動(dòng)物克隆,16.單克隆抗體17.基因工程抗體18.基因診斷19.基因治療20.基因作圖21.差異顯示22.分子進(jìn)化工程,23.分子輔助育種24.生物芯

16、片25.DNA指紋26.酵母雙雜交27.基因捕獲28.RNAi29.基因敲除,ＰＣＲ法：PCR（polymerase chain reaction)技術(shù)是Mullis于1986年發(fā)明的一項(xiàng)體外快速大量擴(kuò)增ＤＮＡ片段的方法（獲1994年諾貝爾獎(jiǎng)）。其基本原理就是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入欲被擴(kuò)增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應(yīng)

17、時(shí)，先加熱至約92℃，使模板變性。降溫至約50℃使引物與模板結(jié)合（退火），加溫至７２℃，在Taq酶作用下，使新ＤＮＡ鏈延伸。重復(fù)92℃（變性）、50℃（復(fù)性）、72℃（延伸）的過程使ＤＮＡ片段得到不斷的擴(kuò)增，可以重復(fù)幾十個(gè)周期。ＤＮＡ片段將2n（ｎ為反應(yīng)周期數(shù)）的倍數(shù)增加。,,人類基因組計(jì)劃1993-1998年的目標(biāo)和截止到1998年10月全球定量完成的情況以及1998-2003年的新目標(biāo),七、生物信息學(xué)簡介,研究內(nèi)容：,（1）各種生物

18、數(shù)據(jù)庫的建立和管理。這是一切生物信息學(xué)工作的基礎(chǔ)，通常要有計(jì)算機(jī)科學(xué)背景的專業(yè)人員與生物學(xué)家密切合作。（2）數(shù)據(jù)庫接口和檢索工具的研制。數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容來自萬千生物學(xué)者的日積月累，最終又為生物學(xué)者們所用。但不能要求一般生物學(xué)工作者具有高深的計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)知識，因此，必須發(fā)展查詢數(shù)據(jù)庫和向庫里提供數(shù)據(jù)的方便接口。這是專業(yè)人員才能勝任的工作，通常在生物信息中心里進(jìn)行。,（3）人類基因組計(jì)劃的實(shí)施，配合大規(guī)模的DNA自動(dòng)測序，對信息的采集和處理提

19、出了空前的要求。從各種圖譜的分析，大量序列片段的拼接組裝，尋找基因和預(yù)測結(jié)構(gòu)與功能，到數(shù)據(jù)和研究結(jié)果的視像化，無不需要高效率的算法和程序。研究新算法、發(fā)展方便適用的程序，是生物信息學(xué)的日常任務(wù)。（4）生物信息學(xué)最重要的任務(wù)，是從海量數(shù)據(jù)中提取新知識。這首先是從DNA序列中識別編碼蛋白質(zhì)的基因，以及調(diào)控基因表達(dá)的各種信號。其次，從基因組編碼序列翻譯出的蛋白質(zhì)序列的數(shù)目急劇增加，根本不可能用實(shí)驗(yàn)方法一一確定它們的結(jié)構(gòu)和功能。從已經(jīng)積累的數(shù)

20、據(jù)和知識出發(fā)，預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，成為常規(guī)的研究任務(wù)。（5）DNA芯片和微陣列的發(fā)展，把一定組織或生物體內(nèi)萬千基因時(shí)空表達(dá)的研究提上日程．研究基因表達(dá)過程中的聚群關(guān)系，從中提取調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑的知識，進(jìn)而從整體上模擬細(xì)胞內(nèi)的全部互相輔合的生化反應(yīng)，在亞細(xì)胞層次理解生命活動(dòng)。只有掌握已有數(shù)據(jù)、發(fā)展嶄新算法，才能創(chuàng)造新的知識。這是生物信息學(xué)剛剛掀開的新篇章。,2、在基因組計(jì)劃中的作用1）高度自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得、 加

21、工和整理2）序列片段的拼接3）基因區(qū)域的預(yù)測4）基因功能預(yù)測5）分子進(jìn)化的研究,遺傳的分子生物學(xué),基因的化學(xué)基礎(chǔ)是什么？遺傳的染色體理論認(rèn)為：基因位于細(xì)胞核內(nèi)染色體上；染色體的主要化學(xué)成份——蛋白質(zhì)和核酸何者為基因的化學(xué)基礎(chǔ)？*“蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)”觀點(diǎn)及其主要論據(jù)?；蚧瘜W(xué)本質(zhì)的條件：具有三種功能(p31)。遺傳功能(復(fù)制與世代傳遞)；表型功能(具有適當(dāng)?shù)目刂菩誀畹谋磉_(dá)機(jī)制)；進(jìn)化功能(能夠產(chǎn)生變異滿足生物進(jìn)化的要

22、求)。,三個(gè)學(xué)派,E. Schrödinger(1945)(薛丁格)：What is life?二十世紀(jì)，由于物理學(xué)、化學(xué)和數(shù)學(xué)研究工作者的加入，在生物學(xué)與遺傳學(xué)研究領(lǐng)域形成了三個(gè)學(xué)派：物理學(xué)——結(jié)構(gòu)——結(jié)構(gòu)學(xué)派；化　學(xué)——生化——生化學(xué)派；數(shù)　學(xué)——信息——信息學(xué)派。,第一節(jié) DNA作為主要遺傳物質(zhì)的證據(jù),一、 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù)二、 DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)(一)、 細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(二)、 噬菌體侵染

23、與繁殖試驗(yàn)(三)、 煙草花葉病毒拆合實(shí)驗(yàn)*三、非核酸類的遺傳物質(zhì),,一、 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù),1. DNA含量的恒定性；2. DNA代謝的穩(wěn)定性；3. 基因突變與紫外線誘變波長的關(guān)系。,,(二)、 噬菌體侵染與繁殖試驗(yàn),1. 背景知識噬菌體侵染與繁殖基本過程：T2噬菌體浸染大腸桿菌后，遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞；利用大腸桿菌的遺傳復(fù)制系統(tǒng)復(fù)制噬菌體遺傳物質(zhì)；利用大腸桿菌的遺傳信息表達(dá)系統(tǒng)合成噬菌體組件；最后組

24、裝形成完整的T2噬菌體。因此只要弄清侵染時(shí)進(jìn)入細(xì)菌的是噬菌體的哪一部分，就可能證明哪種物質(zhì)是遺傳信息的載體。另外：P是DNA的組成部分，但不存在于蛋白質(zhì)中；S存在于蛋白質(zhì)中，但DNA中沒有。,2. Hershey和Chase的實(shí)驗(yàn)(p33),結(jié)果與結(jié)論,試驗(yàn)結(jié)果表明：主要是由于DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才產(chǎn)生完整的噬菌體；結(jié)論：DNA才是(噬菌體的)遺傳物質(zhì)。題外話：與Avery等人研究比較，本試驗(yàn)的精度低得多。但是由于放射性

25、標(biāo)記法(也稱為示蹤原子法)，當(dāng)時(shí)為人們普遍采用；同時(shí)由于核酸研究及其它相關(guān)的成果，本試驗(yàn)結(jié)果很快得到人們的廣泛認(rèn)同。,,(三)、 煙草花葉病毒拆合試驗(yàn),煙草花葉病毒(TMV)是由RNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成的管狀微粒：中心是單鏈螺旋RNA、外部是蛋白質(zhì)外殼。1. 拆分感染試驗(yàn)：將TMV的RNA與蛋白質(zhì)分離、提純；分別接種煙葉，發(fā)現(xiàn)RNA能使煙葉致病，而蛋白質(zhì)不能；用RNA酶處理RNA后接種煙葉也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遺

26、傳物質(zhì)。,2. 重組合試驗(yàn),Frankel-Conrat, Singer (1956)進(jìn)行了圖示試驗(yàn)：綜上所述：到上世紀(jì)中期，多方面證據(jù)都直接或間接地表明DNA是主要的遺傳物質(zhì)，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遺傳物質(zhì)。,,第二節(jié) 核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制,*一、早期對核酸化學(xué)性質(zhì)的研究二、DNA的一級結(jié)構(gòu)三、DNA的二級結(jié)構(gòu)*四、RNA的分子結(jié)構(gòu)*五、DNA的復(fù)制,,*一、早期對核酸化學(xué)性質(zhì)的研究,雖然上世紀(jì)中才認(rèn)識

27、到DNA的生物學(xué)功能，核酸研究卻已有一百多年歷史：F.Mischer(1869)從外科繃帶上膿細(xì)胞核中分離出一種不同于蛋白質(zhì)的物質(zhì)，含磷量高、并具有很強(qiáng)的酸性。他將這種物質(zhì)稱核質(zhì)(素)(nuclein)；A.Kossel(1879)發(fā)現(xiàn)酵母等核質(zhì)具有A、G、T、C四種堿基；R.Altamm(1889)將核素命名為核酸(nucleic acid)。,Kossel(1901)又發(fā)現(xiàn)核酸中具有碳水化合物(糖)；P.A.T.Levene

28、(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖——核糖；Fisher(1914)人工合成核苷酸；P.A.T.Levene(1929)又發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胸腺細(xì)胞核酸含有脫氧核糖.Levene將前者命名為核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)，后者命名為脫氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid, DNA)。并指出動(dòng)、植物中均存在這兩種核酸。,,二、 核酸的一級結(jié)構(gòu),關(guān)于堿基的種類、分子式、核苷酸的種類、結(jié)構(gòu)等內(nèi)容是生物

29、化學(xué)中討論的內(nèi)容，請課后復(fù)習(xí)。在此談三個(gè)關(guān)于核酸一級結(jié)構(gòu)的內(nèi)容：(一)、 “四核苷酸”假說；(二)、 查伽夫定則及其意義；*(三)、 核苷酸序列及其測定。,(一)、 “四核苷酸”假說,P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假說，認(rèn)為：核苷酸是核酸的基本組成單位；核酸是“磷酸—核糖(堿基)—磷酸”的核苷多聚體。四核苷酸假說奠定了核酸化學(xué)基礎(chǔ)。但同時(shí)認(rèn)為：核酸多聚體是由“四核苷酸結(jié)構(gòu)”重復(fù)形成；每個(gè)四核苷

30、酸結(jié)構(gòu)包含四種堿基各一個(gè)；所以事實(shí)上認(rèn)為在任何DNA中，四種堿基是等量的，DNA是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡單重復(fù)。這種觀念影響了人們對核酸生物學(xué)功能的進(jìn)一步認(rèn)識。,(二)、 查伽夫定則及其意義,E.Chargaff于1946-1950年根據(jù)紙層析、離子交換層析和紫外分光光度試驗(yàn)結(jié)果提出查伽夫定則：四種堿基的數(shù)量不是等量的；同一物種DNA堿基組成不變，而物種間則有很大不同；嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量(克分子總量)相等(A+G=T+C)

31、，且A=T、G=C。,*(三)、 核苷酸序列及其測定,查伽夫定則表明：核酸并不是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡單重復(fù)，核酸的堿基序列信息可能具有重要意義。以后的研究表明：堿基序列正是核酸生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，是遺傳信息的內(nèi)在形式。DNA及RNA分子序列分析技術(shù)也是最重要的分子遺傳學(xué)研究技術(shù)：Sanger雙脫氧法；Maxam&Gillbert化學(xué)法；基于化學(xué)法的DNA序列自動(dòng)分析儀已成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。,,三、DNA的二級結(jié)構(gòu),*(一)、D

32、NA分子結(jié)構(gòu)的研究1. 鮑林研究小組2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組3. 沃生、克里克研究小組(二)、 DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,,*(一)、DNA分子結(jié)構(gòu)的研究,在“四核苷酸結(jié)構(gòu)”理論的誤導(dǎo)下，人們普遍認(rèn)為核酸的組成、結(jié)構(gòu)簡單，可能不具有重要功能，一度忽略了對核酸的研究。上世紀(jì)中期，眾多研究表明：核酸是遺傳信息的載體，顯然DN

33、A的結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)一步研究其功能和作用方式的基礎(chǔ)。也由此激發(fā)了科學(xué)家從事核酸結(jié)構(gòu)研究的興趣，當(dāng)時(shí)進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)研究的科學(xué)家很多，最重要有：,1. 鮑林研究小組,主要工作：鮑林(Pauling)等1951年(提出蛋白質(zhì)α-螺旋模型后)開始研究DNA分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。提出DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。

34、評價(jià)：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結(jié)構(gòu)模型研究確立了方向。注：1954年鮑林因研究物質(zhì)聚合力而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組,主要工作成就：Wilkins和Franklin改進(jìn)了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術(shù)；于1951年獲得了更為清晰的圖像；結(jié)果表明：堿基位于螺旋內(nèi)側(cè)而磷酸基團(tuán)在外側(cè)，同時(shí)測得了DNA螺旋的直徑和螺距。,3. 沃生、克里克研究小組,Wa

35、ston、Crick(1951-1953)：研究手段非常簡單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。理論知識深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用。,3. 沃生、克里克研究小組,主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三個(gè)方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型?，F(xiàn)在人們公認(rèn)這是分子遺傳學(xué)建立的標(biāo)志。為此Waston，Crick

36、和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,,1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),,2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義,DNA雙螺旋模型結(jié)構(gòu)同時(shí)表明：DNA復(fù)制的明顯方式——半保留復(fù)制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行半保留復(fù)制。而在此之前對復(fù)制方式人們對一無所知?；蚝投嚯某删€性對應(yīng)的一個(gè)可能的理由：DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基

37、序列；并存在某種遺傳密碼(genetic code)，將核苷酸序列譯成蛋白質(zhì)氨基酸順序。在其后的幾十年中，科學(xué)家們沿著這兩條途徑前進(jìn)，探明了DNA復(fù)制、遺傳信息表達(dá)與中心法則等內(nèi)容。,,3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,,*四、RNA的分子結(jié)構(gòu),,*五、DNA的復(fù)制,DNA復(fù)制的起點(diǎn)(單起始點(diǎn)與多起始點(diǎn))；復(fù)制的方向(單向與雙向)；復(fù)制的拓?fù)鋵W(xué)；鏈的延伸(半不連續(xù))；復(fù)制的終止；單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制；復(fù)制的忠實(shí)性(準(zhǔn)確性)；

38、復(fù)制的酶學(xué)；復(fù)制的調(diào)控。,半保留復(fù)制,復(fù)制叉的結(jié)構(gòu),,*第三節(jié) 遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控,一、中心法則及其發(fā)展二、遺傳信息的轉(zhuǎn)錄(RNA的合成)　　 與RNA的加工三、遺傳密碼及其特性四、遺傳信息的翻譯五、基因表達(dá)調(diào)控,,一、中心法則及其發(fā)展,中心法則(central dogma)闡述生物世代、個(gè)體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過程中的信息流向。最初由Crick提出，并經(jīng)過了多次修正。

39、,中心法則的發(fā)展,反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)：反轉(zhuǎn)錄酶；cDNA。RNA的自我復(fù)制。DNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。,,三、遺傳密碼及其特性,遺傳密碼的基本特性：三聯(lián)性；非重疊性；連續(xù)性；簡并性；有序性；通用性。,三、遺傳密碼及其特性,起始密碼子與終止密碼子：起始密碼子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；終止密碼子(無義密碼子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。通用性的另外情況：,,第四節(jié) 基因的概念與發(fā)展,一

40、、經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念二、生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)　　對基因概念的發(fā)展三、基因的微細(xì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)四、現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念,,二、 生化遺傳學(xué)對基因概念的發(fā)展,生化遺傳及早期分子遺傳研究在兩個(gè)重要方面發(fā)展了基因的概念：基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段，并且在染色體上位置固定、序列連續(xù)；遺傳信息就存在于核苷酸(堿基)序列中?！耙粋€(gè)基因一個(gè)酶”，基因表達(dá)為蛋白質(zhì)；基因的核苷酸序列決定蛋白質(zhì)氨基酸序列。,,

41、T4突變型(rII)遺傳研究,Seymour Benzer(1955)用E. Coli烈性噬菌體T4突變型遺傳研究證明：擬等位基因的說法是不正確的。T4野生型在E. Coli菌苔上產(chǎn)生小而不規(guī)則噬菌斑。T4突變品系按表型可分為：rI、rII、rIII三類。其中rII在E.Coli B上產(chǎn)生快速溶菌現(xiàn)象，形成大而圓噬菌斑，在E.Coli K(λ)上不能生長。,試驗(yàn)方法與結(jié)果,試驗(yàn)方法：最初得到8個(gè)不同的rⅡ突變型品系，8個(gè)突變基因均

42、定位于T4DNA的一個(gè)區(qū)段內(nèi)(rII區(qū)段)；將8種突變型兩兩組合混和感染E. Coli B菌株(雙重感染, double infection)；從混和培養(yǎng)物中提取噬菌體顆粒感染E. coli K(λ)。試驗(yàn)結(jié)果：在菌苔上獲得了許多小而粗糙的野生型噬菌斑。,雙重感染試驗(yàn),野生型的產(chǎn)生與基因內(nèi)重組,結(jié)果分析：回復(fù)突變的頻率很小，不會產(chǎn)生如此高頻率的野生型噬菌體(斑)；所以野生型只能由重組產(chǎn)生。用擬等位基因可以解釋試驗(yàn)結(jié)果；但同時(shí)

43、意味著：rII區(qū)段內(nèi)至少存在8個(gè)擬等位基因。Benzer先后分離到400多個(gè)不同的rII突變。在rII區(qū)段內(nèi)存在如此多的基因顯然是不可能的。結(jié)論：這些基因并不是所謂的擬等位基因，而就是rII區(qū)段突變形成的復(fù)等位基因?；蚴怯筛〉闹亟M單位構(gòu)成，野生型產(chǎn)生于基因內(nèi)重組，從而推翻了經(jīng)典遺傳學(xué)基因不可分性的性質(zhì)。,*雙重感染法繪制rII區(qū)段連鎖圖,操作方法：用兩種rII突變型雙重感染B品系，收集溶菌液；分別接種到B品系、K(λ)品

44、系菌苔上；考察兩個(gè)品系菌苔上的噬菌斑數(shù)目，就可以計(jì)算兩個(gè)突變位點(diǎn)間的重組值；繪制連鎖遺傳圖。由于采用了條件致死選擇系統(tǒng)(即在E. Coli K(λ)上rII不能生長)，分辨率極高，可以檢測到十萬分之一的重組值。,B品系雙重感染的結(jié)果,3. 最小的結(jié)構(gòu)單位,重組值檢測精度可達(dá)十萬分之一，但實(shí)際結(jié)果不會低于0.01%；可推斷基因內(nèi)存在最小重組單位，本澤爾將最小重組單位定義為重組子(recon)。rII區(qū)段存在多種突變的結(jié)構(gòu)表明：基因

45、也并非最小突變單位。Benzer提出用突變子(muton)來描述基因突變的最小單位。理論上講突變子不必等于重組子。但以后研究顯示：突變子和重組子都是一個(gè)核苷酸對或者堿基對(bp)。所以基因內(nèi)每個(gè)堿基均可能發(fā)生突變，任意兩個(gè)堿基間均能發(fā)生交換重組。,,1. 雙突變雜合體的互補(bǔ)作用,假定有兩個(gè)獨(dú)立起源的隱性突變，具有類似的表型，如何判定是屬于同一基因(功能單位)的突變還是分別屬于兩個(gè)基因(功能單位)的突變呢？在二倍體生物中，可以建立雙突

46、變雜合體。雙突變體雜合體有兩種形式，即順式(cis)和反式(trans)，如圖所示：,順反測驗(yàn)與順反子,根據(jù)兩突變反式雙雜合體有無互補(bǔ)作用可以判斷它們是否為同一個(gè)功能單位的突變：突變型?無互補(bǔ)作用?為同一功能單位的突變；野生型?有互補(bǔ)作用?為不同功能單位的突變。這種測驗(yàn)稱為互補(bǔ)測驗(yàn)，也稱為順反測驗(yàn)(cis-trans test)。Benzer將順反測驗(yàn)所確定的最小遺傳功能單位稱為順反子(cistron)，順反子內(nèi)發(fā)生的突變間不能互

47、補(bǔ)。,rII順反測驗(yàn),rII區(qū)段突變的性質(zhì)：rII突變具有共同性狀，按經(jīng)典遺傳學(xué)理論，rII區(qū)段為一個(gè)基因；如果基因是最小的功能單位，它也是一個(gè)順反子。Benzer通過順反測驗(yàn)表明：100多個(gè)rII突變型可以分為A、B兩組，組間突變型間能夠突變，而組內(nèi)的突變型間不能互補(bǔ)；與rII區(qū)段連鎖圖對照發(fā)現(xiàn)：兩組突變分別位于rII區(qū)段的兩端| A | B |。,rII的兩個(gè)順反子,經(jīng)典遺傳學(xué)意義

48、上的一個(gè)基因(rII區(qū)段)實(shí)際上有兩個(gè)順反子(功能單位)。因此基因也很可能不是遺傳的最小功能單位。有些基因具有一個(gè)順反子，有些基因具有多個(gè)順反子。在多順反子情況下，基因是幾個(gè)功能單位的復(fù)合體。Benzer提出“一個(gè)順反子一條多肽鏈”。,,四、 現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念,(一)、 現(xiàn)代基因概念基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段。基因由重組子、突變子序列構(gòu)成的。重組子是DNA重組的最小可交換單位；突變子是

49、產(chǎn)生突變的最小單位；重組子和突變子都是一個(gè)核苷酸對或堿基對(bp)?；蚩梢园鄠€(gè)功能單位(順反子)。,(二)、 基因的功能類型,根據(jù)基因的原初功能可以將基因分為：1. 編碼蛋白質(zhì)的基因，即有翻譯產(chǎn)物的基因。如結(jié)構(gòu)蛋白、酶等結(jié)構(gòu)基因和產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)基因。2. 沒有翻譯產(chǎn)物，不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA不翻譯，如編碼tRNA、rRNA。3. 不轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)段。如啟動(dòng)基因、操縱基因。啟動(dòng)基因是轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA多聚酶

50、與DNA結(jié)合的部位。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與DNA結(jié)合的部位。,(三)、 基因的幾種特殊形式,1. 重復(fù)基因：指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復(fù)基因往往是生命活動(dòng)中最基本、最重要的功能相關(guān)的基因。最典型的重復(fù)基因是rRNA、tRNA和組蛋白基因等。2. 重疊基因：同一段DNA序列，由于閱讀框架(轉(zhuǎn)錄范圍)不同，同時(shí)成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個(gè)基因完全存在于另一個(gè)基因內(nèi)部

51、。,3. 斷裂基因或隔裂基因,生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個(gè)連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中間存在不表達(dá)的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續(xù)的。外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段；內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段。真核生物基因可能是不同外顯子的組合——斷裂基因。,4. 跳躍基因(jumping gene),又稱為轉(zhuǎn)座子(transposon)、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子(transpo

52、sable element)。生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)還認(rèn)為基因在染色體上的相對位置是固定的。后來發(fā)現(xiàn)某些DNA序列可以在染色體上轉(zhuǎn)變位置。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位的過程也是一個(gè)遺傳重組過程；轉(zhuǎn)座子在染色體上轉(zhuǎn)位可能會引起插入位置基因功能喪失(突變)，再次轉(zhuǎn)位離開插入點(diǎn)時(shí)便會發(fā)生基因功能的恢復(fù)。,,第五節(jié) 基因突變的分子機(jī)制,一、locus與site二、基因突變的類型三、DNA的防護(hù)機(jī)制四、DNA修復(fù)與突變的產(chǎn)生五、化學(xué)因素誘變的分子機(jī)

53、制,,一、locus與site,經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：基因是染色體上的一個(gè)點(diǎn)，稱位點(diǎn)(site)?，F(xiàn)代基因概念認(rèn)為：基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區(qū)段；基因是由眾多堿基對構(gòu)成，此時(shí)將一個(gè)堿基對稱為基因的一個(gè)位點(diǎn)(site)；而將基因在染色體上的位置則稱為座位(locus)。,,二、 基因突變的類型,1. 根據(jù)突變所引起的表型改變分為：形態(tài)突變型；生化突變型；致死突變型；條件致死突變型。2. 根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式：

54、堿基替換突變；堿基倒位；移碼(插入與缺失)突變。,二、 基因突變的類型,3. 從DNA堿基序列改變的多少：單點(diǎn)突變(替換)；與經(jīng)典遺傳學(xué)的點(diǎn)突變point mutation比較.多點(diǎn)突變(移碼)。4. 從突變所引起的遺傳信息意義的改變：同義突變；錯(cuò)義突變；無義突變。,,第六節(jié) 遺傳工程,一、 遺傳工程概述*二、 染色體工程*三、 細(xì)胞工程四、 基因工程,,一、 遺傳工程概述,遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本

55、規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上：解釋、研究生物進(jìn)化的原因、過程和規(guī)律(遺傳與進(jìn)化)。改善動(dòng)、植物和微生物的遺傳特性——按照人類的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類型、新品種的人工進(jìn)化過程(育種學(xué))。育種工作的理論和技術(shù)水平在很大程度上取決于遺傳學(xué)所取得的成就。訖今為止，動(dòng)、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細(xì)胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎(chǔ)所取得的。六、七十年代的綠色革命；育種工作面臨的問題。,一、 遺傳工程概述

56、,(一)、 遺傳工程的基礎(chǔ)人類對自然改造的能力取決于對自然規(guī)律的認(rèn)識水平。分子遺傳、生物化學(xué)及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展使生物遺傳操作的能力正在不斷提高。遺傳工程的理論與技術(shù)基礎(chǔ)主要來自于：1. 分子遺傳學(xué)的理論；2. 生物化學(xué)及分子生物學(xué)的成就；3. 細(xì)胞生物學(xué)理論和技術(shù)。,(二)、 遺傳工程的含義,生物技術(shù)生物工程：遺傳工程；蛋白質(zhì)工程、酶工程；微生物工程；……遺傳工程：在分子遺傳理論、技術(shù)的

57、基礎(chǔ)上，通過工程設(shè)計(jì)與施工方式，從細(xì)胞、分子水平改造生物遺傳特性。,作為一個(gè)綜合性的技術(shù)群體系，廣義的遺傳工程包含許多相關(guān)的組成部分，其主要的部分有三個(gè)：1. 染色體工程；2. 細(xì)胞工程；3. 基因工程。狹義的遺傳工程指的是基因工程。,,*三、細(xì)胞工程,細(xì)胞工程的主要技術(shù)和研究領(lǐng)域包括：細(xì)胞、原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)；細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生；體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)、篩選與應(yīng)用；以細(xì)胞、原生質(zhì)體作為基因工程受體；細(xì)胞、

58、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選、鑒定與應(yīng)用。,,(一)、細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生,采用體細(xì)胞雜交在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移與應(yīng)用的必要條件是：細(xì)胞、原生質(zhì)體遺傳全能性能充分實(shí)現(xiàn)，再生成新的生物個(gè)體。對植物而言，細(xì)胞和原生質(zhì)體再生技術(shù)已經(jīng)比較成熟。曾經(jīng)是人們公認(rèn)難題的禾本科植物原生質(zhì)體再生在近二十多年來也已取得巨大進(jìn)展。對動(dòng)物而言，克隆羊“多利”的誕生表明：動(dòng)物細(xì)胞(包括人體細(xì)胞)再生成為個(gè)體都是可能，其技術(shù)實(shí)現(xiàn)需要的僅僅是時(shí)間。,,(二)、植

59、物原生質(zhì)體作為基因工程的受體,最初常用的轉(zhuǎn)基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。在這些組織、器官中：細(xì)胞壁的存在會增加操作的難度；產(chǎn)生細(xì)胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選轉(zhuǎn)化子。因此原生質(zhì)體是最具潛力的植物基因工程受體，轉(zhuǎn)化效率高、篩選方便。,,(三)、細(xì)胞、原生質(zhì)體融合,采用細(xì)胞、原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，通過誘導(dǎo)再生獲得雜種個(gè)體(雙二倍體)，可避免有性雜交障礙。動(dòng)物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁，細(xì)胞融合技術(shù)較植物成熟和成功。當(dāng)然動(dòng)物細(xì)胞

60、融合都局限于獲得雜種細(xì)胞及其無性細(xì)胞系?？梢灶A(yù)見：用雜種細(xì)胞核代替維爾·穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細(xì)胞核可以獲得物種間雜種生物個(gè)體。人與小鼠雜種細(xì)胞的無性細(xì)胞系曾在人類基因染色體定位研究上發(fā)揮重要的作用。植物細(xì)胞融合由于細(xì)胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細(xì)胞壁分離原生質(zhì)體的技術(shù)是植物細(xì)胞雜交的基礎(chǔ)。獲得雜種細(xì)胞及其再生植株后，即可進(jìn)行物種間細(xì)胞核、染色體以及細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移。,,基因工程,所謂的遺傳工程就是在分子水平上

61、，用人工方法提?。ɑ蚝铣桑┎煌锏倪z傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合。然后通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細(xì)胞，使外源ＤＮＡ在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。按人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。所以基因工程（gene engineering）也稱為遺傳工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、ＤＮＡ重組技術(shù)（recombination DNA

62、techniques）。有時(shí)人們還稱它為基因克隆（gene cloning）或分子克?。╩olecular cloning）。 遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細(xì)胞，克隆轉(zhuǎn)化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測等。,第一節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)一、限制性核酸內(nèi)切酸（restriction endonuclease）：這類酶又簡稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶（ restricti

63、on enzyme）。限制性內(nèi)切酶本來是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：,Ⅰ型酶：分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，所以在基因工程中應(yīng)用不大。Ⅱ型酶：分子量較?。?05Da），反應(yīng)只需Mg++

64、的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識別位點(diǎn)是一個(gè)回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。Ⅲ型酶：這類酶可識別特定順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。,同裂酶（isoschizomers)： 指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣

65、的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂、酶對甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）： 指來源不同、識別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。,限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個(gè)字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。羅馬數(shù)字：表示該菌株

66、發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號。例：EcoR I: 來自于Escheria coli RY13的第一個(gè)限制酶。,二、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應(yīng)與DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮ

67、Ａ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。,,平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶

68、切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。,,,,,,,,,,Hpa II Hpa II,BamH I 或Sau3A,三、ＤＮＡ連接酶（DNA ligase） 該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來。 DNA連接酶對具有粘性末端

69、的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。,,四、反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以ＲＮＡ為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。五、DNA pol I及Klenow片段 該酶常用于制備放射性比度比活體標(biāo)記高得多的ＤＮＡ探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（n