生殖發(fā)育毒性研

1、生殖與發(fā)育毒性,主講教師 陳華,生殖過程也稱繁殖過程 生殖細胞的發(fā)生形成 交配 受精 合子形成 著床 胚胎形成及發(fā)育 分娩 哺乳,,,,,,,,外源化學(xué)物對生殖發(fā)育的影響,干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸) 途徑作用于生殖發(fā)育過程 。,生殖毒性和發(fā)

2、育毒性常用的術(shù)語,1、生殖毒理學(xué)(reproductive toxicology)主要研究外源化學(xué)物對生殖細胞發(fā)生、卵細胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過程的損害作用及其評定，評定方法即為生殖毒性試驗（繁殖試驗）。2、發(fā)育毒理學(xué)(developmental toxicology)主要研究外源化學(xué)物對胚胎發(fā)生、胎仔發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育的影響及其評定，評定方法稱為發(fā)育毒性試驗，主要為致畸試驗。,生殖毒性和發(fā)育毒性常用的術(shù)語,3、胚胎毒性

3、 指化學(xué)物對胚胎的選擇毒 性作用。4、胚胎毒物 具有胚胎毒性的物質(zhì)。5、致畸性 指胚胎在器官發(fā)育期接觸化 學(xué)物后，造成永久性結(jié)構(gòu)或 功能畸形。,6、致畸劑 具有致畸性并使出生缺陷發(fā)生率明顯增加的物質(zhì)。7、母體毒性 指對懷孕動物的毒性效應(yīng)。8、發(fā)育毒性（developmental toxicity）指出生前后接觸外源性理化因素引起的在子代發(fā)育為

4、成體之前出現(xiàn)的任何對發(fā)育有害的表現(xiàn)，包括：結(jié)構(gòu)畸形，生長遲緩，功能缺陷及死亡。發(fā)育毒物（developmental toxicant）能造成發(fā)育毒性的物質(zhì)稱為發(fā)育毒物。通常指在未誘發(fā)母體毒性的劑量下產(chǎn)生發(fā)育毒性的物質(zhì)。,,9、出生缺陷（birth defect） 是指嬰兒出生前即已形成的發(fā)育障礙，包括形態(tài)結(jié)構(gòu)異常（畸形）和功能缺陷（如智力低下，代謝和行為的異常）。10、不良妊娠結(jié)局（adverse pregnancy outcom

5、e） 包括子代所有的不良結(jié)果：流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、宮內(nèi)生長遲緩、發(fā)育異常、新生兒和嬰幼兒期死亡等。,生殖毒性,外源化學(xué)物對生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為性淡漠，性無能或各種形式的性功能減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，月經(jīng)失調(diào)或失經(jīng)，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少。,男性生殖毒性,毒物可影響 精子的產(chǎn)生 精子輸送 神經(jīng)系統(tǒng) 內(nèi)分泌系統(tǒng)

6、,精子的產(chǎn)生過程,,特定靶位—睪丸內(nèi)環(huán)境 與精子快速生成過程有關(guān)的細胞分裂和代謝活性，對某些類型的損傷特別敏感。 化學(xué)物特別容易損害DNA或影響快速生長組織需要的細胞蛋白功能或細胞呼吸。 DNA損害 蛋白質(zhì)損傷,下丘腦-垂體-性腺軸激素調(diào)節(jié),下丘腦-垂體-性腺軸 雄激素 黃體生成素（LH） 促性腺激素釋放激素（GnRH）,,,女性生殖毒性,女性生殖系統(tǒng)的

7、功能,卵細胞毒性 阻滯原始卵母細胞，影響進一步的成熟和排卵。如抗癌藥--白消安。卵巢體細胞和生殖道毒性 卵巢體萎縮—環(huán)氧樹脂、呋喃妥因 輸卵管和子宮萎縮—鎘,女性生殖功能激素調(diào)節(jié)和相關(guān)毒性,下丘腦-垂體-性腺軸 促性腺激素釋放激素 （GnRH） 黃體生成素LH 促卵泡素FSH

8、 雌激素 孕激素,,生殖毒性的評價,外源化學(xué)物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。生殖毒性試驗可以全面反映外源化學(xué)物對性腺功能、發(fā)情周期、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發(fā)育可能發(fā)生的影響。,生殖毒性的評價,評定的主要依據(jù)是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。,生殖毒性的評價

9、,試驗方法原則受試動物：性成熟大鼠、小鼠或家兔劑量分組:一般設(shè)立三個劑量組（至少兩個劑量組）和一個對照組染毒途徑:動物接觸受試物的方法應(yīng)參照人類實際接觸途徑,生殖毒性的評價,動物數(shù):每組雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只給藥物時間：雄性交配前60天開始給藥，連續(xù)60天；雌性交配前14天給藥，連續(xù)14天。觀察交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過程情況（正常妊娠率）、子代動物分娩出生情況（出生存活率）、授乳哺育（哺

10、育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。,兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗,繁殖試驗,觀察指標(biāo),受孕率（％）:反映雌性動物生育能力以及雌性動物受孕情況正常分娩率（％）:反映雌性動物妊娠過程是否受到影響幼仔出生存活率（％）:反映雌性動物分娩過程是否正常幼仔哺育成活率（％）:反映雌性動物授乳哺育幼仔的能力除上述４個指標(biāo)外，還應(yīng)該注意出生幼仔是否有畸形存在，對死亡的幼仔應(yīng)進行畸形檢查，可為下一步致畸試驗提供參考,發(fā)育毒理學(xué),發(fā)育毒理學(xué)（deve

11、1opmenta1 toxico1ogy）是研究發(fā)育生物體在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的發(fā)育過程中，由于出生前接觸導(dǎo)致異常發(fā)育的理化因素或環(huán)境條件后的發(fā)病機制（pathogenesis），和結(jié)果的學(xué)科。是毒理學(xué)的重要分支學(xué)科。,畸胎學(xué),最早可以追溯到6500 D.B.。古希臘的名醫(yī)希波克拉底和亞里斯多德認為異常的發(fā)育可以被子宮內(nèi)的創(chuàng)傷或應(yīng)激的物理因素引起，母體的印象和情緒可以影響兒童的發(fā)育。隨著十六、十七世紀(jì)生物科學(xué)的興旺

12、發(fā)展，William Harvey于1651年提出了畸形起因于器官或結(jié)構(gòu)的不完全發(fā)育的發(fā)育障礙學(xué)說，認為可解釋除遺傳起源以外的所有畸形。,現(xiàn)代實驗畸胎學(xué),現(xiàn)代實驗畸胎學(xué)開始于十九世紀(jì)初，許多十九和二十世紀(jì)的胚胎學(xué)家，使用各種不同的物理（震動，倒置，針刺）和化學(xué)因素處理雞蛋，產(chǎn)生了畸形小雞，有神經(jīng)管缺陷、無腦畸型、脊柱裂，獨眼畸型，心臟缺陷，位置顛倒和聯(lián)體雙胞胎。重要的是，他們注意到作用時間在決定畸形類型方面比損傷的性質(zhì)更重要。,發(fā)育毒

13、理學(xué),1935年，Hale第一次報道，維生素A缺乏誘導(dǎo)哺乳動物母豬產(chǎn)下包括突眼和顎裂的畸形后代。之后，許多飲食、環(huán)境因素（化學(xué)和物理因素），如：氮芥，錐藍，激素，抗代謝物，烷化劑，缺氧和x光的致畸作用被研究。 1941年，Gregg報告了母親風(fēng)疹病毒感染在奧地利導(dǎo)致眼睛，心臟和耳缺陷以及智力發(fā)育延遲的發(fā)病率增加，并分析了與感染時間的關(guān)系。,發(fā)育毒理學(xué),1961～1962年，西德的兒科病房中出現(xiàn)了大量罕見的短肢畸形兒，多數(shù)為四肢缺陷、無

14、眼、腭裂、骨骼發(fā)育不全，十二指腸和肛門閉鎖。同一時期，全球出現(xiàn)了5850個短肢畸形兒。McBride和Lenz在德國和澳洲的獨立研究，均確認反應(yīng)停是其原因。反應(yīng)停事件是人類歷史上的一個悲劇。但由此，促進了化學(xué)致畸的研究以及管理法規(guī)的建立。1966年美國FDA提出了三段生殖毒性試驗指南，包括了對致畸等發(fā)育毒性的評價。,短肢畸形兒,短肢畸形兒,人類不良生殖結(jié)局：,著床后的丟失（流產(chǎn)和死胎）估計為31 %；自發(fā)單一畸形大約<10‰

15、；嚴(yán)重畸形的總率在出生時約有2～3 %，到1歲時約6～7 %；出生缺陷有14 %；低出生體重7 %；l歲之前嬰兒死亡率1.4 %；神經(jīng)功能異常占16～17 %；人類正常生育率只有50 %左右。,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,1.著床前期 又稱分化前期，從受精時算起，到完成著床之前。其期限在人類為d11～d12；嚙齒動物為前6d。受損的是相對未分化細胞，致胚泡死亡稱為著床前丟失（preimplantation loss）。

16、一般認為，此時很少發(fā)生特異的致畸效應(yīng)。,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,2.器官形成期 著床后孕體即進入器官形成期，直到硬腭閉合。人是3周～8周。一般認為大鼠、小鼠、兔的著床時間為妊娠d6～d7天，硬腭閉合時間為妊娠d15～d18。器官形成期特別容易感受致畸物的作用而誘發(fā)器官結(jié)構(gòu)的缺陷，即結(jié)構(gòu)畸形，故又稱為致畸敏感期或致畸作用危險期（critical period）。此期以結(jié)構(gòu)畸形最突出，也可有胚胎死亡、生長遲緩。,,,人胚胎主要器

17、官的致畸敏感期,妊娠3周時的胚胎,妊娠6周時的胚胎,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,3.胎兒期 器官形成結(jié)束（以硬腭閉合為標(biāo)志）后即進入胎兒期（人類從d56～d58起），直到分娩。在胎兒期接觸發(fā)育毒物不良作用主要表現(xiàn)為：全身生長遲緩、特異的功能障礙、經(jīng)胎盤致癌和偶見死胎。 免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官的功能異常，包括行為的，精神的，運動的缺陷和生殖力降低等。這些臨床表現(xiàn)需要出生后對子代的仔細觀察和測試才能發(fā)現(xiàn)。,妊

18、娠11周時的胎兒,妊娠18周時的胎兒,發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點,4.圍生期和出生后的發(fā)育期 圍生期從第二十六周至出生后4周，出生后的發(fā)育期 指出生后5周至成體。圍生期是一生中對致癌物最敏感的時期，許多兒童期高發(fā)的腫瘤（急性淋巴細胞性白血病、神經(jīng)母細胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺肌瘤等）都可能與出生前因素有關(guān)。妊娠期或圍生期接觸外源化學(xué)物，會嚴(yán)重影響出生后T細胞、B細胞和吞噬細胞的發(fā)育、遷移、歸巢和功能。

19、出生前后接觸具有發(fā)育神經(jīng)毒性的化學(xué)物，表現(xiàn)為對感覺、運動、自主和認知的影響。,出生后,發(fā)育毒性的劑量-反應(yīng)模式和閾值的概念,三 發(fā)育毒性劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系十分復(fù)雜，并且因化學(xué)物的類型，暴露的時間和劑量而改變。致畸帶 指從NOAEL到胚胎死亡劑量之間的劑量范圍。,發(fā)育毒性的劑量-反應(yīng)模式,主要有以下三類：1.除了在較高劑量幾乎全窩胚胎死亡外，正常胎、生長遲緩和結(jié)構(gòu)畸形同時存在。 2.在遠低于胚胎致死劑量下即可出現(xiàn)致畸，甚至

20、全窩致畸。3.有生長遲緩和胚胎致死但沒有畸形發(fā)生。,閾值,哺乳動物的發(fā)育毒性通常被認為是一種閾值現(xiàn)象。假定的閾值是低于它有害的反應(yīng)不會發(fā)生的母體的劑量。但是，發(fā)育毒性是否有閾值還有爭論。 是否產(chǎn)生畸形依賴于在致病過程中的每個步驟在損傷和修復(fù)之間的平衡。,發(fā)育毒性的物種差異,物種差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯。同一物質(zhì)在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。種間差異即同一物種中不同品系之間存在的差異，在致

21、畸作用中也極明顯。,母體毒性（materna1 toxicity）與發(fā)育毒性,母體毒性 是指化學(xué)毒物對孕母產(chǎn)生的損傷作用，表現(xiàn)為增重減慢、功能異常、臨床癥狀，甚至死亡。目前常常用增重減慢和死亡率來表示。發(fā)育毒性可能是直接對孕體的效應(yīng)或間接通過對母體及胎盤的毒性，以及直接、間接效應(yīng)的組合毒性。,母體毒性與胚胎毒性的關(guān)系,①具有發(fā)育毒性，但無母體毒性。表示致畸作用有特定的機理，與母體毒性無關(guān)。如反應(yīng)停。這類化學(xué)物最容易被忽視也最危險。

22、②出現(xiàn)發(fā)育毒性也出現(xiàn)母體毒性：尤其是當(dāng)發(fā)育毒性只在母體毒性存在時才能被觀察到的時候，發(fā)育效應(yīng)可能是間接的，往往不具有特定的致畸機理。如乙醇和可卡因，主要在母體毒性水平對胚胎/胎兒有有害影響，他們的發(fā)育毒性可能部份歸咎于母體生理學(xué)的紊亂的繼發(fā)效應(yīng)。,母體毒性與胚胎毒性的關(guān)系,③具有母體毒性，但不具有致畸作用：這類物質(zhì)在妊娠期很容易引警覺，避而遠之。④在一定劑量下，既無母體毒性，也不表現(xiàn)發(fā)育毒性。,致畸（發(fā)育毒性）作用機制,1.基因突變與

23、染色體畸變 2.干擾基因表達3.細胞損傷和死亡4.干擾細胞-細胞交互作用 5.通過胎盤毒性引起發(fā)育毒性 6.干擾母體穩(wěn)態(tài),發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,一 動物發(fā)育毒性試驗已為國際接受的試驗程序——生殖毒性的ICH三階段實驗指南。提供了動物種/系選擇，給藥途徑，劑量水平，給藥次數(shù)和間隔，暴露期間，實驗的樣本大小，觀察技術(shù)，統(tǒng)計分析和報告要求的指南。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,三階段試驗：I階段試驗：檢測對生殖能力、早

24、期胚胎發(fā)育的影響（一般生殖毒性試驗）；染毒 雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性著床期間；觀察 受試物對成年雌雄性的生殖功能、配子的發(fā)生及成熟、交配行為、受精、著床前的發(fā)育和著床的影響。,受精過程,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,II階段試驗：檢測對胚胎和胎兒發(fā)育的影響（致畸試驗） ；染毒 從著床-硬腭閉合期間；觀察 受試物對成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、器官形成期的發(fā)育毒性。,致畸試驗,動物選擇: 致畸試驗的動

25、物選擇，除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點。多選擇小鼠或大鼠。,致畸試驗,劑量分組一般應(yīng)先進行預(yù)試，目的是找出引起母體中毒的劑量。最少設(shè)3個劑量組，另設(shè)對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以

26、允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。一般最高劑量不超過LD50的1/5～1/3，低劑量可為1／100～1／30。,致畸試驗,動物交配處理每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動物接觸受

27、試物的時間，必須在器官發(fā)生期。,致畸試驗,胎仔檢查自然分娩前1-2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。,致畸試驗,下列幾方面進行畸形檢查：外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。,致畸試驗,結(jié)果評定活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù):即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計

28、算每個活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)?；纬霈F(xiàn)率:即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。母體畸胎出現(xiàn)率 :即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。,致畸試驗,確定受試物是否具有致畸作用時需注意以下幾點：任何結(jié)果必須通過統(tǒng)計計算方法進行劑量組與對照組對比；必須具有統(tǒng)計學(xué)意義才能認為是陽性結(jié)果.應(yīng)該掌握所用實驗動物品系的自然畸形發(fā)生率。致畸作用中動物物種和品系差異較為顯著，因此要求在兩種動物進行試驗。由于物種差異，對

29、動物不具有致畸作用的外源化學(xué)物對人是否致畸的問題，應(yīng)格外認真對待。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,III階段試驗：檢測對出生前后及哺乳期發(fā)育的影響（圍生期毒性試驗）；染毒 孕母從著床到幼仔斷乳期間；觀察 從著床到子代性成熟的母體生殖毒性（成年雌性生殖功能：妊娠、分娩和哺乳）和子代的發(fā)育毒性（胚胎、胎兒生長發(fā)育，新生幼仔宮外生活的適應(yīng)性，斷乳前后的生長發(fā)育，獨立生活能力和成熟的性功能）。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,二 流行病

30、學(xué)研究和人類的證據(jù)可以用流行病學(xué)方法來研究環(huán)境發(fā)育毒物對人類發(fā)育的影響，包括其性質(zhì)、程度以及原因。 要發(fā)現(xiàn)危險的增加，需要正確發(fā)現(xiàn)異常結(jié)局和暴露，需要足夠大的效應(yīng)和研究人群。病例報告和出生缺陷監(jiān)測登記對獲得對人類的發(fā)育毒性證據(jù)是有用的。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,美國FDA(l979)對于藥物在妊娠期的使用用字母A，B，C，D和X來進行等級評定 A類表示，在妊娠人群中控制良好的研究未能證實有危險。X類表示在妊娠期用藥是不當(dāng)

31、的。 C類，表示危險不能夠被排除。 B和D分別代表與危險的關(guān)系相對地較小，或較大。,Wilson 曾提出確認人類新的致畸物的標(biāo)準(zhǔn)：,1.某種特異的缺陷或幾種缺陷綜合癥的發(fā)病率突然增加； 2.缺陷的增加與某種已知的環(huán)境改變，如某種新藥的廣泛使用巧合； 3.已知在妊娠的特殊階段接觸環(huán)境的改變，產(chǎn)生有特征性的缺陷綜合征； 4.缺少妊娠時引起特征性缺陷嬰兒產(chǎn)生的其他普通因子。,發(fā)育毒性和致畸作用試驗與評價,三、發(fā)育毒性的替代試驗 1