hplc實驗步驟和方法開發(fā)與應用技巧

1、液相色譜的應用以及方法開發(fā),提綱：,一.HPLC的廣泛應用二.方法開發(fā)過程 一）選擇HPLC檢測器 二）分配色譜及選擇流動相 三）方法開發(fā)的具體步驟 四）梯度洗脫方法,一.HPLC的廣泛應用,據(jù)2004年統(tǒng)計，世界上化合物總數(shù)多達4700多萬種在全部有機化合物中僅有20％左右的樣品適用于GC分析而HPLC可對80％左右的有機化合物進行分離和分析,HPLC的廣泛應用,HPLC特別適用于高沸點、大分子、強極

2、性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備 在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學、化工、環(huán)保等領域都有著廣泛的應用潛力。,HPLC的應用領域,在食品研究中的分析應用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素〕維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素〕農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS〕

3、和亞硝酸,HPLC的應用領域,在醫(yī)藥研究中分析應用 藥物分析有USP、BP、CP等標準 常用藥物研究中的應用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽茫呵嗝顾亍㈩^孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應用：生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等

4、)、萜類手性藥物研究中的應用：光學異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強)醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。 在獸藥研究中分析應用,HPLC 的應用領域,在生物化學和生物工程中的應用氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類) 在精細化工分析中的應用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析

5、研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品,HPLC的應用領域,化妝品行業(yè)要控制和分析： 防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；在公安、刑警破案工作需要 投毒藥物、毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類和胺類的檢測,在無機離子分析中應用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析,二.方法開發(fā)的過程,Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J

6、.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2,第一步干什么?,想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---儀器制造商的文獻，如Dionex,Waters對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方

7、法充分了解您自己的樣品,分析時要了解哪方面的情況？,靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?,分離(制備)時要了解哪方面的情況？,要分離（即制備）的樣品量有多大? 要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對分離產(chǎn)物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定如何完成?,使用文獻方法注意點,色譜柱填

8、料的種類、品牌是否相同?注意文獻方法的流動相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）,一）選擇HPLC檢測器,對樣品有響應并有一個輸出信號應該提供在檢測器響應值與樣品濃度之間的線性關系；并且所設計的校正技術應該促進這種關系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應與濃度之間關系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測器是線

9、性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距,用于HPLC的檢測器,沒有任何一種單獨的檢測器可以適應所有的液相色譜分離！HPLC檢測器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型）對溶質(zhì)的物理或化學性質(zhì)響應，一般不反應流動相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測器（通用型） 不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應（通用型）,理想的HPLC檢測器,高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作

10、參數(shù)的響應對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性,靈敏度：信噪比,靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N = 3定量限（LOQ）：S/N = 10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性,,,,6:1,,,,N,,,,S,選擇液相色譜的檢測器,要考慮的因素： 你要分離的化合物/樣品的化學特性化學結(jié)構(gòu)、分子

11、量及紫外光譜等等流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測的需求,選擇液相色譜的檢測器,通用檢測器 RI ELSDMS靈敏度ugngpg線性范圍104否103流速敏感是否是溫度敏感是否否破壞性否是是,選擇性檢測器 ABSFLEC Cond MS靈敏度ngpgfgpgpg線性范圍1051031

12、06105103流速敏感否否是是是溫度敏感否否是是是破壞性否否是否是,吸光度（ UV/Vis）檢測原理,原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎：比耳定律，A＝KCL優(yōu)點：1）對溫度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脫 3） 靈敏度較高，ng級檢測缺點：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì),吸光度（ UV/Vis）檢測的應用

13、,大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器 --多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外/可見檢測器，25%是PDA）,背景吸收的影響,背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動相有紫外吸收,,光電二極管矩陣（Photo Diode Array）,,Photo Diode Array簡稱：PDA或DAD,光電二極管矩陣檢測器（ PDA ）的特點和用途,一種三維水

14、平的吸光度檢測器--采集三維譜圖 兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息在收集色譜圖的同時，得到光譜圖 提供許多有用的功能 -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認 -可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰 -任意波長的色譜再處理 -光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合,熒光（Fluorescence）檢測原理,原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達到激發(fā)態(tài)，當其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光優(yōu)點：熒光

15、檢測器靈敏度高, pg級檢測缺點：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生,熒光檢測器原理,熒光檢測器的應用,環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸 生物技術及制藥,氨基甲酸酯類殺蟲劑,黃曲霉毒素,多環(huán)芳烴（PAH）,維生素,示差折光（Refractive Index）檢測,示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀六十年代末、

16、七十年代初）通常被認為是一種通用檢測器檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì) － 非特異性任何光學介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值,示差折光（RI ）檢測 的原理,原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣 各組分濃度。優(yōu)點：通用型檢測器缺點： 1）對溫度變化敏感 2）不能用于梯度檢測 3）靈敏度低，ug級檢測,返回,示差檢測器的應用,示差折光檢測器

17、是通用型檢測器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以檢測特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物,例如糖類,醇類,酯類以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及復雜樣品純化,蒸發(fā)光散射（ELSD）原理,用氮氣把流動相吹成細霧狀流動相的液滴通過一個預加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比例關系,E

18、LSD － 優(yōu)點及應用領域,通用型 － 比流動相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測可以作梯度實驗；檢測下限可到納克級水平對環(huán)境條件不敏感；可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相應用領域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物,ELSD － 缺點,不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮氣或空氣）不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術蒸發(fā)出的溶劑要引到戶外

19、或通風櫥里對揮發(fā)性化合物的檢測不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器,,,二）色譜基本分類,色譜基本分類： 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質(zhì)可以分為： 1.分配色譜—分配系數(shù) *** 2.親和色譜—親和力 3.吸附色譜--吸附力 4.離子交換色譜—離子交換能力 5.凝膠色譜（體積排阻色譜）--分子大小引起的體積排阻,分配色譜,分配色譜分為： 正相色譜：固定相（填

20、料）為極性，流動相為非極性 反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。 用得最多，約占60-70%相對應的色譜柱： 反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等 正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團為-CN氰基， -NH2氨基等,分配色譜的分離機理,分配色譜概述,反相色譜

21、的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫,流動相極性,流動相洗脫強度,反相色譜最常用的流動相及其洗脫強度： 水< 甲醇<乙腈< 乙醇<丙醇<異丙醇<四氫呋喃 最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水”正相色譜最常用的流動相及其洗脫強度： 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇 **應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法,流動相的選擇原

22、則,樣品易溶，且溶解度盡可能大化學性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收 *黏度低，流動性好 *無毒或低毒，易于操作易于從其中回收樣品易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境,三）方法開發(fā)的具體步驟,先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標準品先用高強度的洗脫液調(diào)節(jié)k’ 值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性通過改變流動相的pH值，使樣品成中性加入“對離子”，使樣品呈中性調(diào)節(jié)

23、柱長度改變柱效及分離速度,反相色譜的方法開發(fā),開發(fā)過程實例色譜條件∶色譜柱：C18，4.6mm×15mm流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度） 舉例中用不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱流速：1ml/min樣品：① 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)② 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)③ 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben

24、),1.改變?nèi)萘恳蜃?K’,譜圖,同樣強度的不同溶劑，改變了流動相α值改變色譜柱,2.調(diào)節(jié)α值改變選擇性,離子型化合物的色譜分離,離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性,3.離子抑制色譜,離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的

25、電離使樣品成中性適用于弱酸性化合物的分離加入TFA,磷酸鹽等降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi),離子抑制色譜實例,而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。,離子抑制色譜的使用范圍,下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換

26、色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法”,4.離子對色譜法,在反相色譜流動相內(nèi)加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組份形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型季銨鹽、叔胺鹽 （正離子），適用于弱酸烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負離子），適用于弱堿烷基長度不同，形成對離子的能力不同,離子對色譜機理,抗組胺及減充血劑藥物的分析,離子對色譜的應用,離子對色譜分析水溶性維

27、生素,用離子對、還是用離子抑制方法？,方法開發(fā)的其他因素,流速對柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進樣量(濃度)對柱效的影響樣品的進樣體積對柱效的影響溶劑粘度對柱效的影響以上因素均影響分離度,色譜方法轉(zhuǎn)換,如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進樣量轉(zhuǎn)換流速,四）液相色譜方法開發(fā),梯度洗脫方法,在這一部分您將學習:,關于梯度洗脫過程及其優(yōu)點.如何優(yōu)化梯度分離.有關梯度分離的一些實用考慮.,液

28、相色譜泵,穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準確及重現(xiàn)的自動溶劑混合準確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮滯后體積梯度分析更為關注目的：在任何情況下保持最高精度,,梯度的洗脫方式,高壓梯度及低壓梯度,梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響,注意∶滯后體積包括進樣器、阻尼 器、混合器及其管路,梯度滯后大小的影響,滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1

29、.0ml/min實際梯度會比設置值晚 2 分鐘響應，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設置值晚20 分鐘響應，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為1~4ml（戴安的4元泵<700µl，高壓泵<400µl ）,滯后體積變化的影響,設計不好的HPLC系統(tǒng)，滯

30、后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準確性不好，造成：方法的適應性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性,色譜柱反壓變化對梯度實驗的影響,P680A LPG without pulse damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: < 1%,,Pump with pulse damperBack-pressure:60

31、bar, 85 bar and 105 barVariation: > 2%,Acclaim 120, C18, 5 µm, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25°C; 5 µL injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 1

32、00 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each,梯度洗脫的特點,優(yōu)點縮短分析時間增加分離能力檢測靈敏度提高缺點儀器設備要求高不適合某些檢測方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復性較低？,一般流出問題,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,早流出峰的分離度差.遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k’范圍寬，所以

33、分析時間長.強保留組分造成柱污染.,等梯度洗脫 - 在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變.,Analytical Education Center,,,,,,,,,,,,,,,,,,,H5929A 11-09,,,,,,,,,梯度洗脫 - 一個解決方案,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,梯度洗脫 - 在分離過程中改變流動相組成.,梯度運行中發(fā)生了什么?,,,,,,,,,梯度方法開發(fā)- 優(yōu)化溶劑梯度,

34、您必須確定: 有機溶劑 初始組成 梯度時間 梯度陡度 梯度形狀,流速 柱長 柱重新平衡時間,選擇梯度陡度,陡,平緩,梯度形狀,%B,time,,,,,,,線性,步進,凹形,凸形,,Analytical Education Center,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,線性梯度,對下列每種情況，您認為使用哪種梯度曲線能改善分離?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

35、,,,線性梯度,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,線性梯度,選凹形梯度曲線,用步進梯度或流速梯度,選凸形梯度曲線,梯度平衡時間的影響（一）,10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時間色譜圖不重復,梯度平衡時間的影響（二）,平衡時間∶6分鐘,平衡時間∶7分鐘,平衡時間∶8分鐘,平衡時間∶9分鐘,平衡時間從6到7分鐘，第一個峰的保留時間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個時間時，平衡充足。,改變流速,5%

36、/min1 ml/min-> 5%/ml,5%/min2.5 ml/min-> 2%/ml,流出順序變化 - 一個梯度洗脫現(xiàn)象,遷移距離,10 cm,開始,25 cm,保留時間 (min),柱長,化合物 A,化合物 B,,,,10 cm,14.2,15.3,,,,,,25 cm,18.2,17.9,,,,,,k’ 和有機改性劑百分含量之間的關系 - 等梯度條件(n.b. k´為對數(shù)坐標),梯度洗脫

37、過程中的遷移,,,Ghost Peaks,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0% MeOH,100%,梯度洗脫的實際考慮,對于下列應用，梯度洗脫可能不適合: 使用強保留添加劑的應用. 離子對色譜應用 在裸硅膠柱上的正相HPLC,Blank run producing ghost peaks due toimpure water.,正確的柱長是多少?,在允許的時間內(nèi)獲得

38、最大分離: 分析時間短 - 短柱，高流速 分析時間長 - 長柱，正常流速,結(jié)論,充分用已知樣品結(jié)構(gòu)確定以哪種方法開始普通反相? 離子抑制? 離子對? 還是其他觀察流動相條件改變時色譜峰的移動根據(jù)變化的方向及大小決定下一步干什么改變參數(shù)時要合理，每次只改動其中一個變量！色譜柱的改變影響最大梯度洗脫有利于復雜樣品的分離,開發(fā)液相色譜方法的考慮因素,分離度是色譜分離中主要考慮的因素除分離度之外，在開發(fā)色譜方法時，以下幾個